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当归多糖对人骨髓早期血细胞发生的影响的实验研究
既往研究表明: 当归多糖(Angelica polysaccharide,APS)是当归补血或促进血细胞发生的有效成分,APS对小鼠多能造血干细胞(CFU-S)、造血祖细胞(B FU-E、CFU-E、CFU-GM、CFU-MK)的增殖分化有显著促进作用.但对其作用的细胞与分子生物学机理尚不清楚,还未见APS对人早期血细胞发生的影响及其调控机理研究的报道.课题旨在阐述当归"补血"的现代细胞与分子生物学机理,为当归的临床用药与开发提供理论指导和实验依据.本研究采用造血祖细胞体外半固体培养技术观察A PS对人多向造血祖细胞(CFU-Mix)增殖分化的作用;造血生长因子生物学活性检测研究经APS诱导制备的骨髓基质细胞、血管内皮细胞和单核细胞培养上清液对CFU- Mix增殖分化的影响;免疫细胞化学研究APS对骨髓基质细胞、血管内皮细胞和单核细胞表达IL-3、GM-CSF蛋白的影响;核酸探针原杂交位技术检测APS对骨髓基质细胞表达IL-3、GM-CSF mRNA的影响.实验结果表明:1.在有外源性(G M-CSF、IL-3、EPO)存在的条件下,APS在体外对CFU-Mix的增殖分化有显著促进作用,当加入APS终浓度为50μg/ml时即可表现出对CFU-Mix的增殖刺激作用,在50μg/ml-300μg/ml浓度范围内随着加入APS浓度的增加 ,集落产率也提高;2.经APS诱导制备的骨髓基质细胞、血管内皮细胞、单核细胞的培养上清液对人CFU-Mix的增殖分化有明显的刺激作用;3.经APS诱导后骨髓基质细胞、血管内皮细胞、单核细胞等表达GM-CSF、IL-3蛋白的水平不同程度提高;4.经APS 诱导后骨髓基质细胞表达GM-CSF、IL-3mRNA水平明显提高.我们推测:APS 对人骨髓早期造血有显著的促进作用.APS可能通过直接和/或间接途径刺激造血诱导微环境中的成纤维细胞、单核巨噬细胞等造血基质细胞合成和分泌造血调控因子GM-CSF、 IL-3,进而促进CFU-Mix的增殖与分化,这可能是当归"补血活血"的细胞与分子生物学机理之一.
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内皮细胞对鼠骨髓造血细胞的增殖和分化作用
探索内皮细胞对小鼠骨髓造血细胞的刺激和诱导分化作用. 人脐静脉内皮细胞取自剖腹产后12hr以内的脐带.按Jaffe法进行培养,建立内皮细胞体外培养模型,收集原代培养的内皮细胞上清液(HECS).按本室常规方法制备骨髓有核细胞.在造血细胞半固体和液体培养体系中加入不同组合的重组造血因子,分为三组 :①粒系培养组加GM-CSF(德国BM公司),终浓度为20ng/ml.②红系培养组加入IL-3(美国SIGMA公司)与EPO(德国BM公司),终浓度分别为20ng/m l和2u/ml.③实验组加入内皮细胞培养上清液,以RPMI-1640为对照组.将上述体系接种于24孔板中,每孔1ml,培养7d,收集细胞,作细胞计数,台盼蓝拒染活力检测.细胞表面标记分析:选用抗红系或粒系的单克隆抗体CD71和CD13(美国 Coulter公司)作细胞表面标记检测.培养后细胞经PBS洗涤,取细胞悬液2～5 ×105细胞),加抗体1μl,4℃孵育30min,用PBS洗去没有标记上的抗体和FITC,重新悬浮细胞,用流式细胞仪(Coulter Elite Esp,美国Coulter公司)进行分析.用T检验分析实验数据以x±SD表示.结果:HECS对小鼠骨髓细胞形成各类造血祖细胞集落具有明显的刺激作用,能够提高BF U-E,CFU-E,CFU-GM集落产率,分别为43.04±5.80,148.7 5±32.20,104.67±9.92(P＜0.05);HECS诱导细胞7d后, 细胞表面表达CD13为93.75±5.38,CD71为59.95±7.10(P＜ 0.05).实验组与阳性对照组基本一致,阴性对照组无集落形成和抗体表达.内皮细胞不但能够促进造血干祖细胞的增殖并且能够诱导其定向分析.以往对骨髓细胞的体外培养均采用琼脂或甲基纤维素半固体培养的方法,在用流式细胞仪进行分析时,由于难以去除琼脂或甲基纤维素对实验的干扰,造成对细胞表面抗原标记的困难,影响了实验的准确性.本实验将小鼠骨髓细胞进行体外液体培养,同时加入不同组合的重组造血生长因子,诱导造血干祖细胞向红系和粒系分析,为流式细胞仪分析细胞特异性抗原的表达提供了新的途径.
