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缺血性脑血管病患者骨髓间充质干细胞的实验研究
目的:观察缺血性脑血管病患者骨髓间充质干细胞形态学特征.方法:将缺血性脑血管病患者自体骨髓中的问充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)经密度梯度离心法分离、纯化和培养,观察原代和传代细胞的形态.结果:原代培养的BM-MSCs佳贴壁时间为3 d,生长性状不一,呈散在圆形细胞群、散在梭形细胞群、克隆圆形细胞群、花带状细胞群、漩涡状细胞群,而传代培养的细胞,增殖速度较快,性状一致,排列规则,呈饱满的梭行.结论:通过体外非诱导培养获得的自体BM-MSCs,有较强的增殖能力和多向分化潜能,为缺血性脑血管病的临床治疗提供了实验依据.
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成年和老年大鼠局灶性脑缺血后室管膜下区细胞增殖的比较研究
目的:比较老年和成年大鼠局灶性脑缺血后室管膜下区(the subventricular zone,SVZ)神经干细胞的增殖情况.方法:制作大脑中动脉梗塞模型,用免疫组织化学方法动态检测室管膜下区5-溴脱氧尿嘧啶(bromodeoxyuridine,BrdU)标记的阳性细胞数的变化.结果:正常组和假手术组成年大鼠SVZ的BrdU阳性细胞明显多于老年大鼠.实验组成年和老年大鼠SVZ的BrdU阳性细胞均在缺血后3 d开始增加,7 d时达到高峰,28 d时仍高于正常水平,且成年大鼠各时间点SVZ的BrdU阳性细胞均明显高于老年大鼠.结论:大鼠脑缺血激活SVZ神经干细胞增殖,成年大鼠干细胞增殖能力强于老年大鼠.
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缺血再灌注对内皮祖细胞功能及iNOS、eNOS的影响
目的 探讨缺血及缺血再灌注对内皮祖细胞(EPCs)增殖、凋亡、迁移能力及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达的影响.方法 采集志愿者外周血,进行体外EPCs培养,将细胞分为三组,对照组、缺氧组和缺氧复氧组,四唑盐(MTT)法检测细胞的增殖能力,Transwell小室法检测细胞迁移能力,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测iNOS和eNOS的蛋白表达.结果 通过共聚焦显微镜观察,3d左右细胞基本贴壁,面积变大.单个核细胞培养7d后,呈集落样生长,多呈梭形.显微镜下三组细胞计数分别为:(1.83 ±0.92)个、(5.07±0.84)个、(2.11±0.74)个.与对照组(0.24±0.04)比较,缺氧组(0.62±0.06)能够促进EPCs增殖,差异有统计学意义(t=12.142,P＜0.05);而缺氧复氧组(0.39±0.06)与对照组差异无统计学意义(P＞0.05).缺氧组(18.28±2.05)和缺氧复氧组(14.08±2.11)细胞迁移数量与对照组(15.14±1.25)比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).缺氧组[(34.57±0.42)％]、缺氧复氧组[(41.08±0.44)％]细胞凋亡率显著高于对照组[(24.83±0.38)％](x2=13.427,15.084,P＜0.05);缺氧复氧组细胞凋亡率显著 高于缺氧组(x2 =9.657,P＜0.05).与对照组比较,缺氧组、缺氧复氧组iNOS、eNOS表达显著升高,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 缺血能够促进EPCs增殖、增加iNOS、eNOS表达,但再灌注治疗后EPCs表达下调.
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视神经损伤激活视网膜干细胞的初步研究
有研究表明,视神经损伤可以引起视网膜干细胞标志物表达增多[1,2].为进一步了解视神经损伤激活视网膜干细胞情况,我们应用液压冲击颅脑损伤仪(FPI)建立视神经损伤动物模型.观察胚胎视网膜十细胞同源转录因子(Chx10)和神经干细胞标志物巢蛋白(nestin)的表达,现将结果报道如下.1 材料和方法
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我国眼内干细胞研究现状与展望
干细胞为机体组织中的一个极小的未分化细胞亚群,具有增生、自我维持、自我更新、能产生大量具有功能的子代细胞.对胚胎干细胞、人成体视网膜干细胞及眼内肿瘤干细胞研究发现,人胚胎及成体视网膜均存在有干细胞,眼内肿瘤如视网膜母细胞瘤、脉络膜黑色素瘤内也有肿瘤干细胞的存在;将不同干细胞移植到视网膜下或玻璃体腔,均能分化成神经元或视网膜结构.干细胞有望成为疾病发病机制及治疗研究突破的新靶点.
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转化生长因子-β2对体外培养的小鼠视网膜干细胞的诱导分化作用
目的 研究转化生长因子(TGF)-β2是否能促进体外培养的鼠视网膜干细胞的分化及其作用的强弱.方法 小鼠胚胎在解剖显微镜下分离视网膜干细胞并进行培养,传代,nestin和chx-10免疫荧光鉴定;将第六代细胞进行诱导分化,并进行抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、抗opsin、抗b-tubulin、抗蛋白激酶C(PKC)免疫荧光染色,鉴定终末细胞.结果 培养细胞经TGF-β2诱导可向成熟细胞分化,免疫荧光检测显示分化细胞的数量较胎牛血清诱导的分化细胞数量多.结论 TGF-β2能诱导视网膜干细胞分化为视网膜细胞;其诱导分化作用强于单独的血清诱导.
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胎儿视网膜前体细胞的分离培养
目的 建立视网膜前体细胞的培养方法.方法 分离8～12周流产胎儿的视网膜神经上皮细胞,采用悬浮和贴壁两种方法分别进行培养和传代,取传代细胞用含5%胎牛血清的、无碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基诱导分化培养14 d,并采用免疫荧光法检测培养细胞诱导分化前后前体细胞和视网膜终末细胞标记物表达的改变.结果 悬浮培养的细胞形成神经球并表达神经干细胞的标记物巢蛋白nestin,但无法成功传代扩增;贴壁培养的细胞可连续传代并表达nestin,传代细胞诱导分化后表达视网膜终末细胞的标记物胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、β微管蛋白(β-tubulin)和恢复蛋白recoverin.结论 从8～12周的人胚胎视网膜神经上皮分离培养的视网膜前体细胞具有体外扩增和多分化潜能.
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人眼脉络膜黑色素瘤OCM-1细胞中肿瘤干细胞的分离纯化
目的 分离及纯化人眼脉络膜黑色素瘤细胞OCM-1中的肿瘤干细胞.方法 将OCM-1细胞复苏,使用Dubecco标准改良Eagle培养基(DMEM/F12)培养后,改用无血清化学限定培养基(SFM),并分离纯化培养肿瘤干细胞,用流式细胞仪检测神经干细胞特异性标记物CD133的表达比率,并对第六代细胞进行神经RNA结合蛋白(musashi-1)免疫细胞化学染色,显微镜下观察阳性细胞比率.结果 在标准DMEM/F12培养基中贴壁生长的OCM-1细胞用SFM培养基培养后,贴壁细胞显著减少,至第6代时细胞均为悬浮团状集落生长,呈现典型的干细胞生长方式.在不同代的细胞中,CD133均有阳性,未经过分离的OCM-1细胞、经过SFM培养并分离的第1、2代OCM-1细胞的阳性比率分别是2.5%、21.7%、57.8%,第6代的细胞CD133阳性比率达到79.8%,musashi-1强阳性表达.结论 脉络膜黑色素瘤细胞中存在肿瘤干细胞.使用干细胞培养液培养,并通过限制分化、连续传代的方法,可分离纯化出悬浮克隆集落生长的干细胞.
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冻存复苏后大鼠视网膜干细胞的增生及分化特性
目的 研究视网膜干细胞冻存复苏后的成活率及再培养后的增生分化特性.方法 对胎龄17 d Long Evans的大鼠眼视网膜干细胞进行分离与体外培养.利用无血清培养基短期体外培养大鼠胚胎来源的视网膜干细胞,将传代三代后的视网膜干细胞以冻存液[体积分数为80%的改良基础培养基(DMEM)/F12,10%牛血清白蛋白(BSA),10%二甲基亚砜(DMSO),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)20ng/ml]于液氮中冻存,于1、2、4、8、12、16周分别复苏,计数活细胞比例进行再培养,并进一步诱导分化,采用免疫细胞荧光化学方法检测视网膜干细胞的增生及分化特性.结果 不同的冻存时间对冻存后细胞存活率的影响无显著差异(P＞0.05),再培养生长良好,具有视网膜干细胞特异性标志,并可进一步诱导分化为视网膜各种类型的细胞.结论 大鼠视网膜干细胞的冻存复苏并不影响其原有的增生及分化特性.
