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钩端螺旋体LA2144基因产物血小板活化因子乙酰水解酶活性的研究
目的：确定问号钩端螺旋体(简称钩体) LA2144基因产物血小板活化因子乙酰水解酶( PAF-AH)活性、感染细胞时表达与分泌情况,以及诱导金地鼠内脏出血的作用。方法采用PCR扩增问号钩体黄疸出血群赖型赖株无信号肽LA2144基因并构建其原核表达系统,采用Ni-NTA亲和层析法提纯表达的目的重组蛋白rLep-PAF-AH。采用分光光度法检测rLep-PAF-AH水解PAF底物的活性、水解效率及Km和Kcat值。采用实时荧光定量RT-PCR( qRT-PCR)和Western blot法分别检测问号钩体赖株感染人脐静脉血管内皮细胞( HUVEC)、人单核细胞THP-1和小鼠巨噬细胞J774A.1后,LA2144基因mRNA( Lep-PAF-AH-mRNA)水平变化及产物外分泌情况。金地鼠尾静脉两次注射100μg无LPS的rLep-PAF-AH后观察肺、肝、肾组织中出血情况。结果所构建的问号钩体赖株LA2144基因原核表达系统在IPTG诱导下能高效表达rLep-PAF-AH,Ni-NTA亲和层析法提纯的rLep-PAF-AH经SDS-PAGE 后显示为单一的蛋白条带。5μg rLep-PAF-AH 对底物的水解效率为26.6 U/L,其Km和Kcat值分别为82.79μmol/L和0.24 S-1。问号钩体赖株与HUVEC、THP-1和J774A.1细胞共培养1或2 h,Lep-PAF-AH-mRNA水平显著升高(P<0.05)。问号钩体赖株与上述细胞共培养2~12 h,培养物上清中检出大量Lep-PAF-AH,但其EMJH培养物上清中未检出Lep-PAF-AH。 rLep-PAF-AH注射金地鼠出现肺出血,但肝、肾组织中无明显出血现象。结论 LA2144基因产物具有较强PAF-AH活性,感染细胞时表达上调并外分泌、诱导金地鼠肺出血,故是问号钩体感染时引起宿主出血的重要毒力因子。
