首页 > 文献资料
-
人IL-4基因修饰诱导肝母细胞瘤细胞凋亡及分化的研究
目的研究人白细胞介素4(IL-4)基因修饰对肝母细胞瘤细胞凋亡及分化的影响及可能机制. 方法以逆转录病毒为载体将人IL-4基因导入人肝母细胞瘤细胞系(HepG2)细胞.台盼蓝拒染、瑞氏染色、放射免疫测定、流式细胞仪细胞周期分析、原位杂交等方法检测人IL-4基因修饰后细胞形态、甲胎蛋白合成以及原癌基因c-fos、c-jun、c-myc 表达的变化.流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双染色法及间接免疫荧光染色法检测凋亡细胞及凋亡调控基因p53、bcl-2的蛋白表达. 结果 (1) 人IL-4基因修饰较空载体修饰及野生型HepG2细胞的细胞周期发生G0/G1期阻滞,甲胎蛋白分泌量及原癌基因c-fos、c-jun、c-myc表达降低(P＜0.001).细胞在形态及功能上趋向正常肝细胞转化;(2) 较空载体修饰及野生型HepG2细胞,IL-4基因修饰后部分细胞形态上出现核固缩等典型凋亡细胞的特征,流式细胞仪亦检测到18.5%±4.7%的凋亡细胞;(3) 人IL-4基因修饰增加p53而抑制bcl-2表达(P＜0.05). 结论人IL-4 基因修饰可诱导肝母细胞的凋亡及分化,诱导凋亡细胞可能与上调p53蛋白及抑制bcl-2蛋白表达有关.
-
人白细胞介素4在大肠杆菌中的优化表达
目的:通过优化设计利用大肠杆菌表达人白细胞介素4(IL-4)并提高其表达量.方法:根据原核翻译起始序列的局部二级结构自由能,设计了AUG上下游序列,并在人IL-4基因下游插入部分大肠杆菌LacZ序列以提高mRNA的稳定性.结果:成功地构建了人IL-4的高效表达克隆,命名为pLCM182-hIL4.SDS-PAGE分析显示所表达的重组IL-4蛋白质占细菌总蛋白的30%.目的基因下游没有插入LacZ序列所构建的表达克隆pCZH-hIL4在大肠杆菌中的表达量则占细菌总蛋白的20%左右.结论:所设计的优化表达方法对人IL-4基因的表达是成功的,在细胞因子的工程化表达中,优化设计对基因的表达量至关重要.
-
重组人IL-4的克隆、表达和鉴定
目的：构建人IL‐4重组表达载体，表达纯化并鉴定人IL‐4重组蛋白。方法采用巢式PCR技术从健康志愿者外周血单核细胞（PBMC）总RNA中扩增人IL‐4开放阅读框基因，将扩增的IL‐4目的基因与表达质粒pET101/D‐TOPO连接，转化大肠杆菌BL21，进行表达纯化和鉴定。结果采用巢式PCR扩增得到IL‐4开放阅读框大小为460 bp ，测序比对显示序列正确。转化BL21后，通过对不同克隆子表达水平的筛选，筛选到高表达 IL‐4的克隆子，表达和纯化后聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS‐PAGE）显示，其融合蛋白大小约为28×103，与目的蛋白大小一致。Western blot鉴定结果显示表达的蛋白正确，为人IL‐4目的蛋白。结论成功表达纯化到人IL‐4重组蛋白。
