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KIR2DL4在NK-92细胞上的超表达及其功能分析
目的克隆KIR2DL4 cDNA,并使其在NK-92细胞上获得稳定表达,分析KIR2DL4分子对NK-92细胞功能的调节作用. 方法采用RT-PCR方法,从人蜕膜单个核细胞扩增出KIR2DL4 cDNA,将目的基因亚克隆于逆转录病毒表达载体构建成KIR2DL4-pLNCX 表达载体,将重组质粒转入NK-92细胞,利用单克隆抗体#33进行FACS检测,观察KIR2DL4分子在靶细胞表面的表达.ELISA检测KIR2DL4对IFN-γ分泌的影响,同时根据LDH的释放实验,分析KIR2DL4分子对NK-92细胞毒功能的调节. 结果 KIR2DL4分子在经KIR2DL4-pLNCX转染的靶细胞表面获得稳定高表达,且不影响其他受体在NK-92细胞上的表达水平.KIR2DL4分子能够部分限制NK-92细胞对HLA-G阳性靶细胞的杀伤作用,交联KIR2DL4分子能够诱导IFN-γ的分泌. 结论成功构建了KIR2DL4-pLNCX逆转录病毒表达载体,并使KIR2DL4分子在NK-92细胞上获得功能性的高表达.
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抗CD19嵌合受体修饰的NK-92细胞的构建及其对CD19阳性非霍奇金淋巴瘤细胞的杀伤作用
目的:构建表达CD19的二代CAR-NK-92细胞系,探讨其对CD19阳性非霍奇金淋巴瘤细胞的特异性杀伤作用.方法:构建表达CD19-CAR基因的载体并包装慢病毒颗粒,感染NK-92细胞,流式细胞术检测感染率,并进一步分选阳性细胞,Western blotting检测CD19-CAR在NK-92细胞中的表达;以CD19阴性骨髓瘤细胞U-266、CD19阳性的非霍奇金淋巴瘤细胞ARH-77和HS-Sultan细胞为靶细胞,以CD19CAR-NK-92为效应细胞,流式细胞术检测细胞杀伤实验中存活肿瘤细胞的绝对数量并计算杀伤率.结果:成功构建慢病毒载体pLVX-CD19-CAR并包装病毒颗粒,感染NK-92细胞后CD 19CAR-NK-92细胞纯度高于90％;Western blotting分析显示CD19-CAR已经成功表达在NK-92中.CD19CAR-NK-92对ARH-77[(70.10±1.86)％ vs (1.95±0.63)％,P＜0.01]和HS-Sultan[(74.98±1.60)％ vs (0.58±1.49)％,P＜0.01]细胞的杀伤率显著高于空载体对照组ZsGreen-NK-92细胞,对U266的杀伤率无显著差别(P＞0.05).结论:成功构建了表达CD19CAR的NK-92细胞系,其对CD19阳性的非霍奇金淋巴瘤细胞有特异性杀伤作用.
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CAR-NK抗肿瘤研究的现状与发展趋势
作为固有免疫中重要的效应细胞,NK细胞具有强大的抗肿瘤功能,在肿瘤免疫治疗方面具有良好的应用前景.随着嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T细胞(CAR-T)技术的兴起,NK细胞的CAR修饰潜力也受到了关注.CAR-NK的研发既传承了经典CAR-T研发的思路,也实现了诸多基于NK细胞生物特点的创新和发展.外周血NK细胞、NK细胞系和干细胞来源的NK细胞各具生物学特色,在CAR-NK研发中被广泛使用.已有靶向多种血液肿瘤和实体瘤抗原的CAR-NK在体外实验和动物模型中取得显著效果.虽然在临床暂未有数据支持CAR-NK的疗效且仍存在一些瓶颈问题需要攻克,但是CAR-NK有望在治疗实体瘤、简化免疫治疗等方面实现新的突破.
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携带TGF-βⅡ型受体及NKG2D融合基因的NK-92细胞生物学特性研究
目的 构建携带TGF-β receptorⅡ(TGF-βRⅡ)胞外段跨膜区及NKG2D胞内段融合基因的NK-92细胞,并检测其生物学特性.方法 通过RT-PCR从人外周血淋巴细胞中扩增出TGF-β receptorⅡ胞外段跨膜区及NKG2D胞内段基因；利用PCR的方法将2段基因融合,并构建含有融合基因的慢病毒穿梭质粒；将该质粒与包装质粒共转染293T细胞,获得慢病毒颗粒并感染NK-92细胞系,筛选出稳定转染的NK-92细胞系；采用流式细胞术检测目的基因在转染后的NK-92细胞系中的表达,用CCK-8的方法检测24 h和48 h时NK-92-TN的存活能力,同时用Transwell的方法检测NK-92-TN的迁移能力.结果 测序表明,成功获得了TGF-βRⅡ胞外段跨膜区与NKG2D胞内段的融合基因；获得了重组慢病毒；通过筛选得到了可稳定表达融合基因的NK-92细胞系,同时NK-92-TN的存活能力和迁移能力要明显优于对照组.结论 成功建立表达TN的NK-92细胞系,并且发现NK-92-TN的存活能力和迁移能力明显优于对照组,从而为NK-92-TN细胞的体内生物学功能的研究工作奠定了基础.
