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免疫缺陷小鼠体内人源化骨髓微环境的重建
目的:通过在免疫缺陷小鼠体内重建人源的骨髓微环境,为进一步研究人异常的骨髓微环境在人白血病发生发展中的作用提供模型.方法:通过反复冻融浓缩后血小板获得人血小板裂解液(HPL),以α-MEM作为基础培养液分别添加10％ HPL和10％胎牛血清(FBS)培养骨髓来源的间充质干细胞.比较两种添加成分对MSC形态、免疫表型、多向分化能力以及增殖能力的影响;将HPL培养的MSC接种于β-TCP支架材料并移植到免疫缺陷小鼠背部皮下,8-12周后取出移植体做HE染色,观察MSC在体内形成骨以及骨髓结构的能力.结果:用HPL和FBS培养的MSC均呈现长梭形纤维样细胞结构,均具有多向分化能力;两种体系培养的MSC免疫表型无明显区别,但用人血小板裂解液培养的MSC具有更强的增殖能力和向成骨分化能力;用人血小板裂解液培养的MSC具有在体内形成骨组织样结构的能力.结论:HPL培养的MSC具有更强的增殖能力以及成骨分化潜能,它能在NOD/SCID鼠上重建人源化骨髓微环境.
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单个细胞来源胎盘间充质干细胞培养方法的比较研究
目的·观察胚胎来源间充质干细胞(placental derived mesenchymal stem cells,PMSCs)在人血小板裂解液(human platelet lysate,HPL)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)及传统的胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)不同组合的培养基中的倍增数目及细胞性状,着重探索更合适的PMSCs培养体系.方法·分离单个细胞来源PMSCs,扩增后分别用4种培养基孵育,分为FBS组、FBS+bFGF组、HPL组以及HPL+bFGF组.观察细胞形态及生长状态、细胞表型及多能分化.在P1、P2、P3、P4代进行计数.取P4代细胞接种,分析集落形成单位的个数.结果·经鉴定,PMSCs具有间充质干细胞的生物特性.数量上,FBS+bFGF组在P4代达到(1.12×107)个/cm2,HPL组达到(1.24×107)个/cm2 (P＞0.05),而FBS组和HPL+bFGF组则只有(5.58×106)个/cm2和(8.56×106)个/cm2.细胞形态上,FBS+bFGF组与HPL组P4代的PMSCs均保持贴壁生长,但HPL组细胞于P5代无法贴壁生长.细胞集落数量上,P4代时,FBS+bFGF组为51个/孔,HPL为52个/孔(P＞0.05).细胞生物学特性上,FBS+bFGF组和HPL组在P4代时均能基本保有间充质干细胞的特性和多能分化的能力.结论·从细胞数量上来看,HPL组中的P4代细胞数与目前常用的FBS+bFGF培养基没有显著差异,且已达到临床治疗剂量需求;从细胞生物学特性上来看,HPL培养基与FBS+bFGF培养基均能基本保持PMSCs细胞特性和多能分化的能力.但由于HPL培养基免疫原性低,因此更适合临床移植应用.然而,由于HPL培养基无法维持PMSCs生长至5代以后,故无法用于大规模细胞扩增.HPL+bFGF在目前实验条件下并不具备优势.
关键词： 胎盘来源间充质干细胞 细胞扩增 碱性成纤维生长因子 人血小板裂解液 -
人血小板裂解液促进人羊膜来源间充质干细胞的成骨分化
目的：：研究人血小板裂解液(HPL)对羊膜来源间充质干细胞(AMMSCs)成骨分化的作用。方法：分别以含7% HPL(HPL组)和10%胎牛血清(FBS,FBS 组)的 LG-DMEM培养介质扩增 AMMSCs,比较两组扩增AMMSCs效率及其免疫表型 SSEA-3和 SSEA-4的表达差异。使用 MSCs 成骨分化培养液诱导 AMMSCs 成骨,对比观察两组钙盐沉积量、钙化结节、碱性磷酸酶(ALP)活性；提取两组成骨诱导后 AMMSCs 总 RNA,采用 RT-PCR检测成骨分化调节因子RUNX-2和ALP mRNA相对表达量。结果：HPL组扩增速度快于FBS组；AMMSCs的 SSEA-3和 SSEA-4表达较 FBS 组明显下调(P<0.05)。HPL 组钙盐沉积量、钙化结节数量、ALP 活性以及RUNX-2和 ALP mRNA表达量均明显高于 FBS组(P均<0.05)。结论：含 HPL培养介质可促进 AMMSCs 成骨分化。
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血小板裂解液快速扩增人羊膜来源间充质干细胞
目的:研究人血小板裂解液(HPL)扩增的羊膜来源间充质干细胞(AMMSCs)的细胞生物学特征.方法:分别以含7% HPL和10%胎牛血清(FBS)的LG-DMEM培养介质扩增人AMMSCs,比较含HPL和FBS介质培养扩增的AMMSCs的形态、扩增效率、免疫表型和多向分化潜能.结果:含HPL和FBS培养介质扩增的AMMSCs形态和免疫表型类似.含HPL培养介质能显著加速间充质干细胞(MSCs)的扩增,扩增的AMMSCs能向成骨、软骨和脂肪细胞分化.结论:含HPL培养介质可促进AMMSCs扩增,可为相关临床治疗提供更多人源化、无伦理争议、临床应用障碍少的MSCs.
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血小板裂解液替代胎牛血清培养间充质干细胞
目的 观察人血小板裂解液(HPL)对脐带间充质干细胞(UC-MSCs)的形态、增殖、表面标志、诱导分化能力的影响.方法 取正常足月妊娠产妇脐带血,离心后收集血沉棕黄层及血清按4∶1混合后-20℃冻存,反复冻融2次后制成HPL,按10％比例加入培养基.分离获得UC-MSCs,在含10％ HPL或10％胎牛血清(FBS)的培养基中培养,比较培养30 d所获得的累积倍增级、大传代代数所获得的细胞数及第3代细胞6孔板中培养6d所获得的细胞量;通过流式细胞仪检测HPL对培养细胞的表面标志的影响;观察HPL对培养细胞的成骨、成脂及成软骨诱导分化能力的影响.结果 HPL或FBS培养的UC-MSCs形态相同,均为长梭形,传至第3代形态无明显改变.在HPL或FBS中培养30 d所获得的累积倍增级比较差异无统计学意义(P＞0.05);HPL培养的细胞在第10代的细胞量[(7.5±0.4)×106个]明显多于10％ FBS组[(4.3±0.2)×106个];第3代UC-MSCs在6孔板培养6d后,HPL组所得细胞数明显多于FBS组(P＜0.05).流式结果显示,UC-MSCs表面高表达CD44、CD73、CD90、CD105,不表达或低表达CD11b、CD19、CD31、CD34、CD45及人类白细胞抗原DR基因(HLA-DR).与10％ FBS培养的UC-MSCs比较,10％ HPL培养并未影响其表面标记的表达.HPL或FBS培养的UC-MSCs均能进行三系诱导分化,其分化能力无明显差异.结论 HPL可以代替FBS来进行培养和扩增UC-MSCs.在保持其形态、表面标志、分化能力不变的情况下,UC-MSCs在HPL环境下增殖更快.
