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B7.1真核表达载体文献资料
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人B7.1真核表达载体的构建、鉴定及其在白血病细胞上表达的实验研究
本研究构建包含人B7.1cDNA的重组真核表达戢体pDisplay-hB7.1并鉴定,实现其在白血病细胞株HL-60细胞上的表达,获得HL60-hB7.1.应用分子克隆、PCR法扩增人B7.1基因片段,采用ApaI、SalI分别双酶切PCR产物和表达载体pHook,纯化后的酶切产物由T4 DNA连接酶连接,转导大肠杆菌DH5α;应用Apal、SalI双酶切和DNA序列分析技术进一步鉴定阳性克隆pDisplay-hB7.1,应用脂质体转化技术将B7.1转染HL-60细胞,同一标本分别采用直接免疫荧光法、SABC法及FACS法鉴定hB7.1在HL-60细胞上的表达,阳性细胞命名为HL60一hB7.1.结果表明,PCR法扩增出约620 bp的基因片段;连接产物转导感受态细胞后,共筛选出5个阳性克隆,均可经ApaI、SalI双酶切出大小约620 bp的基因片段,与人B7.1基因片段大小相符,提示重组载体构建成功.进一步DNA序列分析证明人B7.1基因序列和读码框架正确,与文献报道人B7.1 cDNA序列一致,无基因突变.直接免疫荧光法鉴定表明,HL600-hB7.1阳性细胞数为70%,SABC法鉴定为65%,FACS法鉴定为92.7%.经以上鉴定证实hB7.1 cDNA已成功转染HL-60细胞株并在其膜上高效表达,获得了HL60-hB7.1.结论:应用分子克隆方法可成功构建人B7.1(CD80)重组真核表达载体,并稳定、高效表达B7.1-于HL-60细胞胞膜上,推测应用这种方案制备的瘤苗可能具有免疫治疗和免疫保护作用.
关键词： B7.1真核表达载体 白血病 基因治疗 免疫治疗
