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常用基因表达系统的特点及其在寄生虫抗原制备中的应用
寄生虫病仍然是威胁人类健康的重要疾病.与细菌及病毒不同,大多数寄生虫为多细胞生物,其抗原成分复杂,抗原结构随着寄生虫的生长发育而不断变化.即使是单细胞寄生虫如原虫,抗原结构也随着虫期的转换而发生变异.由于寄生虫抗原构成的复杂性、多变性及大多数寄生虫尚未建立人工体外培养技术,通过基因工程技术大量制备寄生虫重组抗原对寄生虫病的诊断与防治就显得尤为重要.如何根据基因表达系统的特点选择合适的体系获得高效表达,是研究中常常面临的重要问题.
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人IL-24基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
IL-24既能抑制肿瘤细胞生长和血管形成并诱导肿瘤细胞凋亡,又能诱导免疫细胞分泌IL-6、TNF-α、IFN-γ等多种细胞因子.在对乳腺癌、肠癌、肺癌及胶质瘤等肿瘤基因治疗中有显著的抗肿瘤效果.目前有关建立IL-24基因表达系统,开展rhIL-24蛋白生物学特性研究及产品研制,国内外鲜见报道.本文为本项研究的起步.
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脑胶质瘤特异性6HRE-GFAP-Baxα基因治疗系统的构建
脑胶质细胞瘤基因治疗的关键是治疗的安全性和有效性,因此需要构建对胶质瘤特异而高效表达的基因表达系统.目前研究中多采用端粒酶逆转录酶催化亚单位(human telomerase reverse transcriptase,bTERT)启动子介导凋亡基因表达,然而该启动子表达效率低下,限制了进一步的应用.本实验依据恶性胶质瘤体内部低氧的微环境,构建对低氧敏感的6HRE-GFAP杂合启动子(hypoxia responsive element,低氧反应元件)和(glial fibrillary acidic protein,胶质纤维酸性蛋白),使之介导治疗基因在胶质瘤细胞内表达,产生治疗作用,而正常脑组织细胞虽有基因转染,但不表达毒性产物,从而构建出针对胶质瘤细胞特异而高效的表达载体.
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蜕皮素药理作用研究进展
节肢动物蜕皮素(节肢动物类固醇激素)是主要调节节肢动物发育的激素.蜕皮素具有多种生物学作用.现就蜕皮素的结构、在哺乳动物体内的代谢、蜕皮素受体、可诱导蜕皮素的基因表达系统以及蜕皮素的药理作用的相关研究作一综述.
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杆状病毒表达系统在疫苗研究中的应用
目前使用的体外基因表达系统有多种,各有其优缺点.常用的大肠杆菌原核表达系统操作方便,表达稳定,但表达基因的分子量有限,不能对表达产物进行翻译后修饰.动物细胞表达具有良好的翻译后修饰功能,但成本高,操作复杂.杆状病毒表达系统是近年来日益受到重视的又一个重要的表达系统.现介绍如下.
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四环素调控基因表达系统的研究新进展
基因的表达调控特别是转录水平的调控,是一个非常复杂的过程,涉及到多个因素的相互作用,尤其是反式作用因子,体外对这些因子的调控研究时,往往由于它们对细胞的损害而得不到满意的结果.
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蛇毒类凝血酶基因工程的研究进展
蛇毒类凝血酶(Thrombin-like enzyme,TLE)是蛇毒中与血浆凝血酶性质相似的一类丝氨酸蛋白酶,所不同的是在蛇毒类凝血酶结构中已经没有纤维蛋白稳定因子激活组分.由于蛇毒类凝血酶在新药研究中扮演重要角色,比如来自Bothrops jararaca和Bothrops atrox蛇毒的立芷雪、来自东北白眉蝮蛇毒的邦停和来自尖吻蝮蛇毒的苏灵,它们是具有止血作用的新药;来自Gloydius shedaoensis和Gloydius ussuriensis蛇毒的东菱克栓酶、来自白眉蝮蛇和尖吻蝮蛇毒的降纤酶、来自Calloselasma rhodostoma蛇毒的安克洛酶和来自Crotalus adamanteus蛇毒的Crotalase,它们是具有溶栓作用的新药.这些药用蛋白质的来源和产量因有限的蛇毒原料而有很大限制,通过基因克隆可解决资源问题.文章综述了蛇毒类凝血酶的基因结构、糖基化特点和各种重组表达体系,为大量制备供临床和基础研究使用奠定基础.
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TAp73γ在Saos-2细胞中定量诱导体系的建立
目的利用Tet-On基因表达系统建立Saos-2/Tet-On/TAp73γ细胞株,通过强力霉素(Doxycycline,Dox)定量诱导TAp73γ基因的表达.方法将质粒pRevTet-On、pRevTRE-Luc和pRevTRE-TAp73γ分别转染PT67细胞,产生相应的逆转录病毒.RevTet-On病毒感染Saos-2细胞,经G418选择培养基进行培养并感染RevTRE-Luc,再应用荧光素酶活性检测筛选出高诱导倍数的Saos-2/Tet-On细胞克隆.后该细胞株感染RevTRE-TAp73γ病毒,用强力霉素筛选出阳性细胞,在不同浓度Dox诱导下用Western blot分析Saos-2/RevTet-On/TAp73γ细胞中TAp73γ的表达.结果 Saos-2/RevTet-On克隆5当培养基中Dox浓度达到2.5mg/L时,荧光素酶相对活性值为5.3×106RLU/s,去除Dox时荧光素酶活性弱,背景低.Western blot结果显示在Saos-2/Tet-On 5细胞中TAp73γ蛋白表达随着Dox浓度的增加而增加.结论建立了Saos-2/Tet-On及Saos-2/Tet-On/TAp73γ细胞株,可利用四环素衍生物定时定量调整Saos-2细胞中TAp73γ基因的表达,为研究TAp73γ细胞内协同作用因子、进一步阐明细胞内p73蛋白的生物学行为提供了一个理想的研究平台.
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Tet-on调控TAp63γ基因表达EC9706细胞系的建立及对细胞增殖的影响
目的:利用Tet-on 基因表达调控系统建立由强力霉素(Dox)诱导TAp63γ基因表达的EC9706细胞系,为进一步研究TAp63γ基因的功能奠定基础.方法:将调控质粒pTet-on 转入EC9706细胞,经G418筛选后的细胞再次转染反应质粒pTRE-TAp63γ-HA,再用潮霉素筛选出阳性细胞克隆,RT-PCR法选择对Dox敏感的细胞克隆.后用不同浓度Dox诱导,Western blot法确定Dox的佳诱导浓度.采用此浓度的Dox分别诱导EC9706、EC9706/Tet/pTRE、EC9706/Tet/pTRE-TAp63γ 3组细胞,细胞增殖分析试剂盒(CCK-8试剂盒)检测细胞生长抑制率.结果:Dox浓度为3 mg/L时可诱导TAp63γ基因高表达,EC9706/Tet/pTRE-TAp63γ细胞的生长抑制率均高于EC9706和EC9706/Tet/pTRE细胞(P<0.05或0.01).结论:成功构建了Tet-on 调控TAp63γ基因表达的EC9706 细胞系,为进一步研究食管鳞癌细胞内P63蛋白的生物学行为提供了一个理想的研究平台.TAp63γ基因表达可使EC9706细胞增殖受到抑制.