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携带EGFP基因的戊型肝炎病毒重组质粒的构建及其感染性的验证
为了构建携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)重组质粒,转染人肺癌细胞A549细胞验证其感染性,PCR法分两段扩增HEV全基因组序列和EGFP基因序列,将EGFP报告基因插入到HEV ORF2基因下游,并克隆到体外转录表达载体pGEM(@)-7Zf(+)上.然后利用脂质体转染法将重组质粒转入A549细胞,24 h后在荧光显微镜下观察EGFP的表达;转染72 h后,利用免疫荧光法检测HEV ORF2蛋白的表达.转染7d后将发生病变的A549细胞收集作为接种物,接种A549细胞验证携带EGFP的HEV-EGFP重组病毒的感染性.结果显示经酶切和测序鉴定携带EGFP的HEV重组表达质粒pGEM-HEV-EGFP构建成功;EGFP基因与HEV在A549细胞中可融合表达;携带EGFP的HEV重组表达质粒转染A549细胞7d后出现病变,并且连续传代3代仍具有感染性.本研究成功构建了携带EGFP的HEV全基因组重组质粒pGEM-HEV-EGFP,并成功感染A549细胞,为进一步研究HEV的复制机制及致病机理奠定基础.
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EGFP基因转染骨髓间充质干细胞的实验研究
目的:探讨外源性EGFP基因转染修饰兔骨髓间充质干细胞(m esenchymal stem cells,MSCs)的可行性.方法:用增强型荧光绿色蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)作为报告基因,以脂质体法转染骨髓间充质干细胞,观察转染结果、表达情况及对靶细胞活力的影响.结果:经荧光显微镜下观察证实:成功地对骨髓间充质干细胞实现了基因转染.结论:兔骨髓间充质干细胞能够在体外适宜的条件下进行长期培养;骨髓间充质干细胞可直接作为基因靶细胞,建立稳定表达EGFP的骨髓间充质干细胞系具有可行性,为进一步做标记的MSCs细胞的移植研究奠定基础.
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西藏小型猪骨髓间充质干细胞分离培养及慢病毒载体介导EGFP标记间充质干细胞
目的 建立一种简便、有效的西藏小型猪骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外分离培养及纯化方法,并基于BMSCs建立慢病毒介导的外源基因EGFP体外投递系统.方法 密度梯度离心法分离西藏小型猪BMSCs,差速贴壁法不断纯化,流式细胞仪检测第3代BMSCs CD45、CD90和CD105表达；此外,用携带EGFP基因的慢病毒转染BMSCs以获得EGFP标记的BMSCs,倒置荧光显微镜下观察感染情况及流式细胞术检测感染效率.结果 ①密度梯度分离法结合差速贴壁法所获得的细胞经鉴定符合MSCs的特性.②借助慢病毒高效率将EGFP导入BMSCs,感染效率为84.1％.结论 利用密度梯度分离法结合差速贴壁法可获得高纯度的BMSCs,基于BMSCs 建立了慢病毒介导的外源基因体外投递系统.
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增强型绿色荧光蛋白基因在鸡胚盘细胞中的表达
从鸡胚发育为X期的鸡蛋中取胚盘细胞,经原代培养后用带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)作为标记基因的真核表达质粒pLEGFP-C1转染鸡胚细胞观察EGFP基因的表达情况,结果在不同条件下的活细胞均见有EGFP基因的稳定表达.这提示通过EGFP基因转染鸡胚盘细胞可连续且直接观察活细胞中的表达,为转基因鸡的研究提供一实用的标记基因.
关键词： 增强型绿色荧光蛋白(EGFP) 鸡胚盘细胞 转染 脂质体 -
MK-EGFP融合蛋白的构建和表达
目的 克隆中期因子(mid kine,MK)的编码序列,构建MK-EGFP融合表达质粒,诱导表达并亲合纯化.方法 用RT-PCR技术从人胚胎组织中获得MK编码基因,构建原核表达质粒pET-MK-EGFP;转化大肠杆菌,诱导表达重组蛋白;纯化回收后鉴定生物活性.结果重组质粒经酶切测序与预期相符,融合蛋白表达后的指示荧光于激光共聚焦显微镜下清晰可见,MK在其中保持了原有的完整构象和生物活性.结论 MK-EGFP重组质粒构建正确,融合蛋白大量表达,并具有完整的生物学活性.
关键词： 中期因子(MK) 增强型绿色荧光蛋白(EGFP) -
抗日本血吸虫生殖功能分子SIEA26～28kDa单链抗体与EGFP的融合表达及靶向性研究
目的 体外观察抗日本血吸虫生殖功能分子SIEA26～28kDa单链抗体与日本血吸虫各阶段的靶向部位,探讨单链抗体在抗血吸虫病疫苗研究中的应用价值.方法 扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,克隆至PET32a/SIEA26～28kDa-scFv质粒,构建PET32a/EGFP-scFv质粒.转化至感受态E.coli BL21(DE3)中,并诱导表达单链抗体融合蛋白,分析单链抗体融合蛋白与SIEA26～28kDa的结合特异性.单链抗体融合蛋白与日本血吸虫成虫、虫卵切片孵育,荧光显微镜下观测GFP信号,确定特异性单链抗体的靶向性.结果 重组质粒PET32a/EGFP-scFv构建成功,Trx-EGFP-scFv融合蛋白高效表达,与SIEA26～28kDa特异性结合.GFP信号主要集中在未成熟卵卵胚,雌虫卵巢、卵黄腺及与生殖系统邻近的肠腔组织.结论 SIEA26～28kDa单链抗体与血吸虫未成熟卵胚胎及雌虫生殖系统具有较强的靶向性,具有潜在抗卵胚发育、抗雌虫生殖作用,为SIEA26～28kDa单链抗体在抗日本血吸虫病疫苗免疫靶向方面的研究奠定了基础.
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EGFP逆转录病毒载体构建及在人骨髓间质干细胞中的表达
目的:构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)逆转录病毒载体,转染人骨髓间质干细胞(hMSCs),探讨EGFP作为组织工程种子细胞示踪剂的可行性.方法:构建携带EGFP基因的逆转录病毒载体,用阳离子脂质体介导法将病毒质粒导入包装细胞,取阳性包装细胞克隆的病毒上清感染hMSCs,筛选稳定表达EGFP的细胞克隆(hMSCs-EGFP),MTT法测定hMSCs-EGFP的生长曲线.结果:病毒上清转染hMSCs后,绿色荧光蛋白能稳定表达一个月以上,生长曲线显示转基因细胞增殖速度和未转染细胞无明显差别.结论:hMSCs转染EGFP后,不影响其生长,EGFP可作为组织工程种子细胞良好的示踪剂.
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pET15b-EGFP原核表达载体的构建及其表达和纯化
目的:利用中间载体pGEM-T easy vector 构建表达型载体pET15b-EGFP ,在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白EGFP并将其纯化.方法:以质粒pLEGFP-C1为模板采用聚合酶链反应(PCR)的方法特异性扩增EGFP cDNA序列,利用Taq DNA聚合酶的非模板依赖性末端转移酶活性催化PCR扩增的EGFP序列和三磷酸脱氧腺苷(dATP)反应,在EGFP序列两3'端加"A",将纯化后的EGFP序列与中间载体pGEM-T easy vector连接后转化感受态大肠杆菌DH5α,经蓝白筛选,挑取白色单菌落进行扩增﹑酶切鉴定,正确重组的质粒命名为pGEM-T-EGFP.用XhoI和BamHI分别双酶切pGEM-T-EGFP和pET15b,低熔点琼脂糖回收EGFP cDNA和线性化的pET15b片段后将两片段相连,转化感受态大肠杆菌DH5α并对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序,获取正确重组的表达型质粒并命名为pET15b-EGFP.将正确重组的质粒pET15b-EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达.利用表达蛋白N端的组氨酸"标签"(His-tag)进行Ni2+-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化蛋白质. 结果:经测序证实重组质粒pET15b-EGFP中的EGFP cDNA序列与从Clontech公司购买的质粒pLEGFP-C1中的EGFP cDNA序列完全一致,从而成功构建了表达型重组质粒pET15b-EGFP.pET15b-EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)并经诱导后得到高效表达,表达量可达66 mg/100 ml菌液,SDS-PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为目的蛋白EGFP.结论:表达型重组质粒pET15b-EGFP的成功构建和表达、纯化为细胞穿透肽-EGFP融合蛋白穿透细胞能力的研究奠定了基础.
关键词： TA克隆载体 增强型绿色荧光蛋白(EGFP) 重组质粒 蛋白表达 蛋白纯化 -
巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)融合EGFP真核表达载体的构建及表达
目的构建真核表达重组体pEGFP-M-CSF,并鉴定其在小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞能否正确表达.方法PCR扩增M-CSF基因,定向克隆入带有EGFP报告基因的真核表达载体,构建真核表达重组体pEGFP-M-CSF,脂质体介导将pEGFP-M-CSF转染入NIH3T3细胞,以一步法RT-PCR检测其在NIH3T3细胞中的表达情况.结果双酶切及测序鉴定证明成功构建真核表达重组体pEGFP-M-CSF,并在NIH3T3细胞中成功地表达了融合荧光蛋白,RT-PCR检测结果显示RT-PCR扩增产物与M-CSF目的基因片段大小相符,确实源于重组质粒转录后的mRNA.结论真核表达重组体pEGFP-M-CSF的成功构建及在体外真核细胞中有效表达,为进一步研究M-CSF在真核细胞中的信号调控奠定了一定的实验基础.
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子宫内膜细胞诱导胚胎干细胞修复小鼠受损子宫内膜
目的:探讨小鼠胚胎干细胞(ESCs)经体外与子宫内膜细胞共培养后移植于内膜损伤小鼠的子宫腔是否有助于损伤的修复并降低其成瘤性.方法:制备新鲜子宫内膜损伤的小鼠模型,利用带EGFP基因标记的小鼠胚胎干细胞(ESC-EGFP)与同种子宫内膜共培养后移植至模型鼠宫腔；观察ESC-EGFP在模型鼠宫腔内滞留情况、对损伤内膜的修复影响以及对干细胞移植后成瘤性的影响.结果:将与子宫内膜共培养后的ESC-EGFP移植到新鲜损伤的模型鼠宫腔内,可使损伤子宫的外形较PBS对照组保持更好,移植后1～4周的损伤子宫大体标本均可见荧光；组织病理可见新生子宫内膜腺体样组织,并显示GFP免疫组织化学标记；且在有限观察时间内无肿瘤形成.结论:ESCs与子宫内膜细胞共培养方式可能诱导ESCs分化的方向,而在体子宫腔损伤的局部环境有利于胚胎干细胞定植与进一步向子宫内膜分化.
