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高通量测序技术用于丙型肝炎病毒感染溯源调查
目的：建立检测丙型肝炎病毒（HCV）准种群的Hiseq高通量测序（Hiseq测序）技术，并调查一起疑似通过共用针具传播HCV的案例。方法针对2015年1月15日在美沙酮门诊发现的1例HCV抗体阳转静脉注射吸毒者（编号P1），调查在其可能感染HCV的时期内（2014年3月24日之后）与其共用针具、HCV抗体阳性的4例静脉注射吸毒者（编号P2～P5）的流行病学信息，并以与P1在同一美沙酮门诊服药或者居住在同一乡镇、HCV抗体阳性的28例静脉注射吸毒者（编号C1～C28）作为研究对照。分别采集上述33名的全血样品5 ml，提取血浆中的RNA并逆转录后进行HCV基因亚型分析，对亚型与P1相同的样品进行Hiseq测序，分析样品中HCV的准种分布情况，计算样品内和样品间的基因离散率，绘制系统进化树。结果 P1样品的基因亚型为3b，与其亚型相同的样品有P2、C7、C12、C14、C15、C16、C19、C20、C28。其中9份成功进行了Hiseq测序，获得的有效序列数为249753～1086333条（平均869608条）。剔除重复序列后，获得3～172个（平均48个）独特准种群的序列。9份样品的样品内基因离散率中位数（P50）为0.4%～12.3%；P1与其余8份样品间基因离散率的P50（P25，P75）分别为19.0%（18.4%，19.8%）、10.4%（2.8%，18.3%）、19.6%（17.8%，21.4%）、24.9%（23.8%，26.1%）、19.8%（18.7%，20.7%）、20.1%（18.9%，21.2%）、20.6%（20.0%，21.1%）、23.6%（22.4%，24.8%），差异无统计学意义（T=9.40，P=0.100）；P1与C7个别准种群间的基因离散率为0。系统进化分析显示， P1与P2之间无传播关系，但与C7之间可能存在传播关系。结论 Hiseq测序技术可以在准种水平上有效地用于HCV感染溯源调查，具有高通量、操作较简便、成本相对低、实用价值较高的特点。
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高通量测序技术在黄连解毒汤抗白念珠菌机制研究中的应用及探讨
白念珠菌(Candida albicans)是临床上发生为普遍的致病真菌,严重时可危及生命,目前主要以三唑类药物进行防治.但是由于药物长期广泛的使用及其作用位点的单一性,导致耐药问题日益突出.中药黄连解毒汤有良好的抑菌效果,并极大增强西药杀菌作用,但至今相关其分子机制的研究鲜有涉及.本文在阐述目前国内外现有高通量基因测序技术的基础上,重点探讨了高通量技术在黄连解毒汤抗白色念珠菌机制研究中的应用.
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基于高通量测序技术对牛蒡子药材与伪品药材混合粉末鉴定研究
牛蒡子是我国传统中药,主要伪品为毛头牛蒡、水飞蓟、云木香、大翅蓟、紫穗槐等果实.传统鉴定方法或分子条形码技术可以对牛蒡子和其伪品进行鉴定,但是对牛蒡子与其伪品混合粉末的鉴定较困难.该文利用高通量测序技术对牛蒡子以及其5种伪品混合粉末ITS2序列进行测序,对混合粉末物种进行鉴定,为牛蒡子药材混合粉末的鉴定提供新思路.对药材混合粉末中的总DNA进行提取,并对总DNA中ITS2片段进行扩增,利用Illumina MiSeq平台对群落DNA片段进行双端(paired-end)测序,利用FLASH,QIIME以及GraPhlAn等软件对序列进行整理分析.结果显示:混合样品中共得到高质量的ITS2序列39910条,其中,样品中的物种ITS2序列共34935.进一步的进化分析表明样品中含牛蒡子、毛头牛蒡、水飞蓟、大翅蓟、云木香和紫穗槐.利用高通量测序技术,以ITS2序列作为DNA条形码,可以检测出混合粉末中含有牛蒡子及其伪品,为牛蒡子药材质量控制、安全用药以及中药混合粉末的鉴定提供参考.
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高通量测序技术在新生儿地中海贫血基因筛查中的应用
目的:探讨高通量测序(NGS)技术在新生儿地中海贫血基因筛查中的可行性.方法:随机采集我院出生的206例新生儿足底血,制成干血片,用高通量测序(NGS)技术进行地中海贫血基因筛查,根据其结果进行进一步的分析.结果:206例受检新生儿中筛查出地中海贫血基因突变的有22例,其中α-地中海贫血11例,β-地中海贫血11例,新发5例.11例α-地中海贫血以基因缺失为主,共7例,所占比例达到64％ (7/11),具体基因型分布:右侧缺失型(αα/-α37)4例,东南亚型(αα/-SEA)2例,左侧缺失型(αα/-α4.2)1例,其余4例为基因点突变所致,占36％ (4/11),分别为:Hb Part-Dieu杂合、Hb Quong Sze杂合、Hb Westmead杂合、HBA1:c.95 +9C＞T(新发突变);11例β-地中海贫血主要为β-链基因点突变所致,共检出7种突变基因型;以CD17(A→T)位点的突变多见,占27％(3/11),-50 G＞A杂合2例、Hb Hamilton杂合1例、IVS-Ⅱ-654(C→T)1例,其余4种为新的基因位点突变,分别为:HBB:c.316-116C＞A、HBB:c.316-248G＞T、HBB:c.315 +63T＞C、HBB:c.-23 A＞G.结论:高通量测序技术对新生儿足底干血片进行地中海贫血基因筛查是可行的,不仅能有效地检出地中海贫血的基因类型,而且还能发现新的基因突变.本方法具有采集标本简单、结果精确度高等优点,可广泛应用于临床,为地中海贫血的早期诊断提供保障.
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无创 DNA产前检测技术在诊断胎儿唐氏综合征中的应用
目的：利用高通量测序技术检测孕妇外周血中的胎儿游离 DNA,探讨唐氏综合征无创产前检测的应用价值。方法：选择唐氏综合征高风险而进行确定诊断的单胎孕妇115例,用孕妇血浆进行无创DNA产前检测。同时,采集羊水,进行染色体核型分析,并以该结果为“金标准”,将无创DNA产前检测结果与羊水细胞核型诊断结果作比较分析。根据Y染色体比对的reads数目,计算孕妇外周血中胎儿DNA的含量。结果：115例孕妇经新型无创DNA产前筛查判定胎儿为唐氏综合征高风险15例,唐氏综合征低风险100例；结果显示100例新型无创DNA产前检测为唐氏综合征低风险的胎儿,其染色体常规G显带分析均为正常核型；15例无创DNA产前检测为唐氏综合征高风险样本中,14例羊水染色体结果确诊为唐氏综合征,1例羊水染色体分析为正常。结论：新型无创DNA产前检测技术的灵敏度和特异度与羊水细胞核型分析结果高度一致,其安全、无创及高通量的优势具有更为广泛的临床应用价值。但DNA检测明确有21-三体综合征高风险的孕妇,也必须进行羊水穿刺进一步确诊。
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高通量测序技术在遗传性疾病实验诊断中的应用
高通量测序技术(high-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术,具有高准确性、高灵敏性以及高性价比的绝对优势,对于传统医学和疾病研究而言是一次革命性的改变,对遗传性疾病的诊断和筛查起着非常关键的作用.本文介绍了高通量测序技术的作用原理,回顾新一代测序在遗传性疾病临床分子诊断实验室中的应用.随着高通量测序技术的继续发展和个性化医疗的不断普及,不但会给生命科学研究带来更多的资源和便利,而且将对改善人类健康及生活质量起到巨大的作用.
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基于高通量测序技术对五种白头翁药材混合样品的DNA分子鉴定研究
中药白头翁应用历史悠久,药典收载为毛莨科植物白头翁Pulsatilla chinensis (Bge.) Regel的干燥根.市场流通中易混淆种有朝鲜白头翁、兴安白头翁、细叶白头翁、金县白头翁等,伪品众多,准确鉴定十分迫切.本研究采用宏基因组学的方法,基于高通量测序技术对5种白头翁药材混合样品的ITS2序列进行测序.首先对药材混合粉末中的总DNA进行提取,并对总DNA中ITS2片段进行PCR扩增,再利用Illumina MiSeq平台对DNA片段进行双端测序,后采用FLASH、QIIME以及GraPhlAn等软件对序列进行整理分析并与本课题组前期上传至GenBank中的序列进行聚类分析.结果显示,混合样品中共得到53024条ITS2序列,有效序列52295条,白头翁属5种药材总计49 079条,其代表序列与本课题组前期上传至GenBank中的序列进行聚类分析后,5种白头翁分别聚为一支,呈单系性.结果表明,利用高通量测序技术,以ITS2序列作为DNA条形码,可以对5种白头翁药材的混合粉末进行有效鉴定,为混合中药材的基原鉴定提供新的方法和思路.
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高通量测序技术在临床医学中的应用进展
高通量测序技术(第二代测序技术)近年来取得快速发展,与第一代测序技术相比具有速度快、准确率高、成本低等优点,主要以454测序技术、Solexa测序技术以及SOLiD测序技术为代表.高通量测序技术在生命科学以及医学领域方面的研究越来越广泛,该文介绍了几种高通量测序技术的作用原理以及它们在临床方面的应用情况.
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第二代高通量测序技术的原理及其在医学中的应用进展
第二代高通量测序技术近年来取得了较快发展，与第一代测序技术相比具有速度快、准确率高、成本低等优点，主要包括454测序技术、Solexa测序技术以及SOLID测序技术。高通量测序技术在医学领域的研究越来越广泛，本文介绍了几种高通量测序技术的作用原理以及它们在临床方面的应用情况。
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高通量DNA测序技术与疾病诊断及预防
高通量DNA测序技术是具有速度快、准确率高、通量高等优点的分子检测新技术。高通量测序技术在生命科学及医学领域方面的研究和应用越来越广泛，分析与挖掘测序得到的基因组大数据，提炼出与疾病相关的遗传变异信息，可以为疾病的诊断、治疗和预防提供科学依据。笔者从产前检查、肿瘤诊断、重大疾病预防、健康相关宏基因组分析等方面介绍高通量测序技术在临床医学方面的应用情况。高通量测序技术在临床医疗中正在发挥着不可替代的作用，是推动精准医学的发展的关键技术之一。
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高通量测序技术在生殖遗传学检测中的应用
近年来,高通量测序技术因其效率高、 成本低、 特异性好等优势被广泛用于临床医学研究中,在无创产前检测、 胚胎植入前遗传学诊断与筛查以及表观遗传学研究中DNA甲基化位点的检测等生殖遗传学领域发挥重要作用.概述目前主要测序平台的原理及特点,系统介绍其在生殖遗传学领域的应用,以期为高通量测序技术在精准医学研究中的广泛应用提供理论指导.
关键词： 高通量测序技术 无创产前检测 胚胎植入前遗传学诊断与筛查 DNA甲基化 -
肾气虚型体外受精-胚胎移植患者卵巢颗粒细胞基因表达研究
目的:利用基因组学技术观察肾气虚证不孕患者与正常女性卵巢颗粒细胞的差异基因,进一步筛选差异基因并行基因功能分析,以期找到中医理论在不孕方面的科学依据.方法:选取肾气虚证的行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的不孕患者33例作为肾气虚组,选取33例因男方因素行卵胞浆内单精子显微注射(ICSI-ET)的正常女性作为正常对照组.所有患者均在取卵日提取成熟卵泡颗粒细胞RNA,运用高通量测序技术分析,研究肾气虚组与正常对照组的基因表达的差异.结果:①肾气虚组和正常对照组间的卵巢颗粒细胞存在差异表达基因.②差异表达因共395条,其中,肾气虚组比正常对照组表达水平上调的有304条,表达水平下调的有91条.涉及细胞凋亡、信号转导、炎症反应,生物合成,免疫调节应答等39个生物学途径,其中涉及细胞凋亡的基因BCL2L12,BCL2L12P1,BCL2L13,BAX,P53AIP1有明显变化.结论:①基因高通量测序技术是研究肾气虚证不孕相关基因的一种理想的技术方法.②开展肾气虚证不孕患者与正常女性基因表达谱的比较研究,可以为中医学经典理论提供现代基因分子水平层次的科学依据.
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高通量测序技术在静脉血栓栓塞症检测中的应用进展
研究发现,遗传因素在静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism,VTE)的发生发展中起着关键作用,但目前确定的遗传因素仅占VTE发病风险因素的60％[1],提示尚有许多相关基因缺陷未被发现.因此,还需要探讨新的方法来发现更多影响VTE发生的遗传危险因素.
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第二代分子诊断技术在检验医学中的研究进展
随着各种疾病机制研究的深入和分子生物学不断发展，分子诊断技术发展迅速。分子诊断技术是利用分子生物学的理论、技术和方法来研究人体内源性和外源性生物大分子及体系的存在与否及结构、表达情况，为疾病的预防、诊断、监测等提供依据，主要包括核酸诊断和蛋白质诊断。其先后经历了分子杂交技术、常规PCR等阶段，传统的分子诊断技术已不能很好的满足临床应用。随之第二代分子诊断技术应运而生。
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高通量测序技术在慢性咽炎患者咽部细菌耐药基因检测中的应用价值
目的：探讨高通量测序技术在慢性咽炎患者耐药基因分布中的应用。方法选取2010年5月至2012年5月本院门诊收治的慢性咽炎患者360例，采集患者咽后壁分泌物，提取质粒 DNA 并进行 Solexa 高通量测序，通过比对在 NCBI 质粒基因组数据库进行物种鉴定，通过与 ARDB 数据库进行比对进行耐药基因鉴定。结果本研究共鉴定出307个质粒，分属25种病原菌，所占比例高的为α-溶血性链球菌（12．87％），其次为副流感嗜血菌（9．86％）。通过与 ARDB 中已知的380种 ARG 比对，共有4015条序列与已知耐药基因序列一致。其中氨基糖苷类耐药基因、β内酰胺酶类耐药基因、大环内酯类耐药基因及四环素类耐药基因占较高的比例。同时我们也检测到一个多重耐药基因 lsa。结论高通量测序技术可以高效、准确地检测慢性咽炎患者中咽部细菌的耐药基因，为临床慢性咽炎治疗方案的选择提供理论基础。
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高通量测序技术在骨质疏松研究中的应用
高通量测序（HTS）技术几乎改变了生物医学科学的每一个领域，近年来高通量测序技术发展飞快，将人们真正带入了HTS 的时代。新一代高通量测序技术具有测序通量高、测序时间短和测序成本低等特点。2015年初，美国总统奥巴马宣布推出精准医疗计划〔1〕。精准医疗是在分子生物学基础上更精准、更个体化的医疗。 HTS 技术为精准医疗的实施提供了强大的技术支撑，为疾病的研究、预防、诊断及治疗提供了更精准，更有效的手段。随着老龄化社会的到来，骨质疏松（OP）已成为影响人们生活质量的一大疾病。60岁以上老年人，OP 发病率男性为35．8％，女性为73％，接近40％的妇女一生中都会发生OP 导致的骨折〔2〕。而 OP 的发生、发展是一个多基因控制的复杂过程。因此，HTS 技术的发展能更加系统地阐述 OP 的发生、发展机制及为其诊断和治疗提供强有力的工具。
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乳腺癌患者化疗前后外周血B细胞BCR H-CDR3受体库动态变化特征
本文利用高通量测序(high-throughput sequencing,HTS)技术对早期乳腺癌患者化疗前后,随着WBC总数及淋巴细胞的变化对外周血B细胞BCR H-CDR3受体库进行分析,探讨化疗对其的影响.分别采集和分离3例进行TAC化疗的乳腺癌患者在化疗前、中、后的PBMC,提取其总DNA并采用多重PCR建库和制备BCR H-CDR3受体库后Illumina检测CDR3序列并分析.结果发现:1.TAC化疗前患者WBC、淋巴细胞绝对值均正常,而化疗中、后WBC、淋巴细胞绝对值虽仍正常,但较化疗前下降;2.P2化疗中较化疗前受体库多样性有所下降,化疗后较化疗中稍升高,但仍明显低于化疗前;P1、P3化疗中多样性都比化疗前高;化疗后,P1较化疗中降低,但高于化疗前,而P3化疗后较化疗中明显升高;3.3例患者化疗后出现不同程度IGHV取用丢失.由此提示:1.化疗后随着WBC、淋巴细胞绝对值的下降,P2乳腺癌患者在化疗中及化疗后受体库的多样性在整体水平上较化疗前有所下降,考虑是TAC对受体库的多样性造成损伤;而P1、P3化疗中与化疗后B细胞受体库多样性整体上都较化疗前高,可能是机体对化疗药物产生的应激反应不一致,TAC杀伤了高频克隆的B细胞,间接增加了CDR3受体库的多样性;2.3例早期乳腺癌患者化疗后出现不同程度IGHV取用丢失,提示化疗可能对B细胞IGHV表达和取用产生了一定的影响,并且IGHV-IGHJ家族取用和配对在不同时间点存在优势配对(＞0.03)现象,可能与乳腺癌相关抗原诱导有关;3.HTS检测化疗前后B细胞H-CDR3受体库变化可为揭示化疗对患者B细胞应答的影响及B细胞的免疫状态提供辅助.
关键词： 高通量测序技术 乳腺癌 化疗 BCR CDR3受体库 -
高通量测序技术在无创产前筛查中的临床应用及研究进展
介绍了母体外周血中胎儿游离DNA(cff DNA)及其发现后聚合酶链反应(PCR)技术在产前诊断中的应用.重点从测序技术、数据分析和解读、临床应用现状及质量控制几个方面介绍了新一代高通量测序技术在产前筛查中的研究进展和临床应用,并对高通量测序技术在产前筛查母体癌症检测中的应用作了简单介绍.
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外显子捕获-高通量测序技术用于法洛四联症胎儿遗传学检测
目的 用外显子捕获-高通量测序(exon-capture high-throughput sequencing,EC-HTS)技术寻找法洛四联症(tetralogy of fallot,TOF)胎儿可能存在的遗传学致病性证据,并探讨其在产前分子遗传学诊断中的价值.方法 选择经超声心动图发现且G显带和微阵列比较基因组杂交(array-based comparative genomic hybridization,aCGH)分析结果均正常的9例TOF胎儿作为研究对象,以63个人类已知的先天性心脏病致病基因作为检测靶点制作捕获芯片,用EC-HTS技术进行检测,数据经过Calling、数据库比对、软件分析得到终病理性突变位点;并用Sanger测序对其进行验证.结果 在9例胎儿中共检测到单核苷酸多态性(SNP)位点732个,结果经过生物信息学分析得到致病性突变位点3个:CITED2c.574_579 del AGCGGC(p.S192_G193de1纯合突变,CHD7c.2550_2554 del GAGAA(p.K850Nfs*6)杂合突变,NOTCH2 c.4918T＞C(p.F1640L)杂合突变.Sanger测序结果验证了这3个突变位点的真实存在,父母溯源检测发现这3个点突变均为新发突变.结论 用靶向性EC-HTS技术发现了3例TOF胎儿存在病理性基因突变,可能为其致病的遗传学病因.
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无创产前检测在高龄孕妇产前筛查唐氏综合征中的应用
目的 探讨无创产前检测(non-invasive prenatal testing,NIPT)在高龄孕妇产前筛查唐氏综合征(Down syndrome,DS)中的应用价值.方法 采用高通量测序技术检测高龄孕妇血浆中胎儿游离DNA(cell-free Fetal DNA,cffDNA),结合生物信息分析,得出胎儿患染色体病的风险率;DS高危的高龄孕妇再用羊膜腔穿刺术进行胎儿染色体核型分析.结果 2 789例高龄孕妇中检测失败2例(0.07％,2/2 789).余2 787例中共检测出25例DS高风险胎儿,阳性率0.9％ (25/2 787),经羊水染色体核型分析证实24例为DS,1例核型正常.NIPT用于高龄孕妇检测DS胎儿的敏感性为100％(24/24),特异性为99.96％(2 762/2 763),假阳性率为0.04％(1/2 763).NIPT还检测出16例其他染色体非整倍体高风险,均进行羊水穿刺术,其中确诊12例胎儿染色体核型异常.NIPT应用于2 789例高龄孕妇产前检测,其中共有43例进行有创性产前诊断,穿刺率为1.54％.结论 NIPT用于高龄孕妇检测DS胎儿具有高敏感性和特异性、无创取样的优点,但目前NIPT检测仍存在假阳性.对染色体结构异常无法准确检测.NIPT检测高风险者仍需有创性产前诊断.
