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丙型肝炎病毒核心区截短型基因真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达
目的:建立截短的丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中瞬时表达. 方法:应用多聚酶链反应(PCR),以HCV-H株全长cDNA序列为模板,扩增获得C区羧基端部分缺失的基因片段,克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),并通过脂质体转染至CHO细胞. 结果:构建了真核表达载体pcDNA3.1-Ct,成功转染CHO细胞,间接免疫荧光和RT-PCR证实pcDNA3.1-Ct在CHO细胞中表达截短型的C蛋白. 结论:成功构建羧基端部分缺失的HCV C区基因的真核表达载体,瞬时转染CHO细胞,为进一步基因免疫和构建多表位卡介苗(BCG)活载体疫苗奠定基础.
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丙型肝炎病毒核心蛋白引发肝脂肪变性及其分子学机制
了解HCV核心蛋白在诱发肝脂肪变性中的分子学机制,对丙型肝炎相关性脂肪肝的病因学,预防和治疗等方面具有极大的促进作用.国内外学者通过大量的研究发现,核心蛋白可诱发肝脂肪变性,其机制可能涉及脂质积聚、与脂质代谢相关酶分子或载脂蛋白的结合、对脂转移蛋白酶活性的调节等方面.
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核心蛋白在肝癌中的作用
了解核心蛋白在丙型肝炎病毒(HCV)致癌中的机制,对于肝癌的病因学以及治疗具有极大的促进作用.在这一方面,国内外的学者进行了大量的理论研究和相关的实验,提出了核心蛋白可能的致癌机制:核心蛋白的核转位表达及突变;影响细胞的周期、增殖以及凋亡;激活原癌基因,影响抑癌基因的表达;影响端粒酶、血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)以及细胞的信号转导等.
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丙型肝炎病毒F蛋白的发现及其特性
目的丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白是近年来在感染HCV的患者血清中发现的一种蛋白,是由HCV核心蛋白编码序列在翻译时发生核糖体读码框移位(-2/+1)产生的,主要位于胞浆中,与内质网相连,推测它在此发挥功能;F蛋白能诱导宿主的体液免疫应答及T淋巴细胞介导的特异性细胞免疫应答.本文就有关HCV F蛋白的发现及其特性进行综述.
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HCV核心蛋白在HCV感染致病过程中的作用
丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白能与细胞的多种蛋白结合,调节多种细胞基因的转录活性,影响宿主细胞凋亡和免疫系统的功能,还影响HCV感染细胞的增殖和分化等,在HCV感染的病理发生和慢性化以及宿主细胞的恶性转化等过程中起重要作用.
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HBV核心蛋白结构与功能及其在基因治疗策略上的应用
核心蛋白对乙型肝炎病毒(HBV)复制过程起关键的作用.近年来对HBV核心蛋白(HBc)单体及其形成的核壳结构与功能有了深入的认识,HBc基因特定部位中插入外源基因后,其产物在细胞内仍能正确地折叠和自身装配,因而有可能在细胞内表达假HBc并掺入240个野生型HBc后,共同形成核壳结构,抑制其功能的发挥,干扰HBV复制.本文就HBc结构与功能区域的基础生物学及其在基因治疗策略上的应用进展作了综述.
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雷公藤内酯醇对小鼠肾小球足细胞裂孔隔膜核心蛋白表达干预作用的研究
目的观察雷公藤内酯醇（TP）干预高糖环境培养的小鼠肾小球足细胞裂孔隔膜nephrin、podocin和CD2AP的表达，探讨雷公藤治疗糖尿病肾病（DN）蛋白尿的分子生物学机制。方法培养成熟的小鼠足细胞随机分为对照组1、对照组2、高糖组和TP干预组，TP干预组进一步分为低剂量、中剂量和高剂量组。用不同浓度的TP（8、16和32ng/ml）干预高糖（25mmol/L的Glu）培养24h后的小鼠足细胞，用 RT- PCR法检测干预前后nephrin、podocin和CD2AP mRNA的表达；用间接免疫荧光法检测16ng/ml TP干预后nephrin和podocin蛋白的表达。结果（1）与对照组相比，高糖诱导的足细胞nephrin、podocin和CD2AP mRNA表达均明显减弱（均P＜0.01）。（2）TP显著上调高糖诱导的足细胞nephrin、podocin和CD2AP mRNA的表达（均P＜0.05）。（3）16ng/ml TP能明显上调高糖对足细胞nephrin和podocin（均P＜0.05）蛋白表达的抑制。结论 TP显著上调高糖诱导的足细胞nephrin、podocin和CD2AP的表达，可能是其降低DN蛋白尿的机制之一。
关键词： 雷公藤内酯醇 糖尿病肾病 肾小球足细胞裂孔隔膜 核心蛋白 -
慢性乙型肝炎患者HBV核心区与聚合酶区特异性CTL表位变异分析
目的 比较急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎与慢性重型乙型肝炎患者HBV C蛋白和 Pol蛋白特异性 CTL 表位变异的差异,以探讨乙型肝炎重症化和慢性化的可能机理.方法 对516例乙型肝炎患者的血清进行HLA-A2和A11分型;用巢式PCR扩增血清HBV C基因与Pol基因并对PCR产物进行序列测定;根据HBV S基因序列,用VirusBlast软件鉴定患者感染的HBV基因型;用Vector NTI软件对目前已知的HLA-A2限制性的4个C蛋白和5个Pol蛋白特异性CTL表位与HLA-A11限制性的1个C蛋白表位进行序列分析.结果 247例(47.86%)患者HLA-A2阳性,其中 AHB 67例,CHB 109例,CSHB 71例;220例(42.64%)患者HLA-A11阳性,其中 AHB 67例,CHB 107例,CSHB 46例;CTL表位变异分析结果如下:①在3组HLA-A2阳性患者,表位变异发生率无显著性差异(P>0.05);②在三组HLA-A2阳性HBV B基因型患者,P455-463和P816-824表位变异有极显著性差异(P<0.01);③在三组HLA-A2阳性HBV C基因型患者,各表位变异无显著性差异;④在三组HLA-A11阳性患者,C88-96表位变异发生率有显著性差异(P<0.05),三组HBV C基因型患者,表位变异发生率有极显著性差异(P<0.01),而在HBV B基因型患者,各表位变异无显著性差异(P>0.05).结论 某些HBV C蛋白和Pol蛋白特异性CTL表位在AHB、CHB和CSHB患者间变异有明显差异,并且受感染病毒基因型的影响.CTL表位变异可能与乙型肝炎的重症化和慢性化机制相关.
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乙型肝炎病毒核心质粒的构建及原核表达
目的构建乙型肝炎病毒核心区原核表达质粒并进行原核蛋白表达、纯化和鉴定.方法应用基因工程技术将编码截短型乙型肝炎病毒核心蛋白(HBcAg 1～144aa)的基因片段装入原核表达载体pRSET-B内,在宿主菌B121(DE3)plysS内进行诱导表达,运用Ni-NTA方法纯化目的蛋白.采用酶联免疫吸附实验(ELISA)及Western blot检测蛋白的灵敏度和特异性.结果成功地构建了含截短型乙型肝炎病毒核心区基因的质粒,并纯化得到了分子量约为19.5kD的目的蛋白.结论本方法所获得的重组截短型乙型肝炎病毒核心抗原(1～144a)纯度高,免疫反应性强.
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HBV病毒复制机制及慢性乙型肝炎药物靶点
乙型肝炎病毒( HBV)感染是一种严重影响公共卫生与人体健康的全球性流行性疾病，尽管乙肝防治已有很大提高，但仍缺乏高效的药物与手段。研究表明，肝损伤、肝衰竭程度与HBV及宿主免疫系统相互作用存在复杂关系。因而详细地探明HBV生命周期和感染过程，为研究HBV药物靶点和制定新的抗病毒策略提供前期坚实的基础，意义重大。该文详细介绍HBV病毒复制机制，并系统地阐述近年来新发现的和潜在的药物靶点，为制备新型的抗HBV药物提供参考。
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HBV核心蛋白突变体L60 V重组质粒的构建及其应用于IFN-α抗病毒机制
目的构建乙型肝炎病毒核心蛋白( HBc )突变体L60V重组质粒,并探讨L60V拮抗α干扰素( IFN-α)抗病毒活性的机制。方法构建HBc突变体融合表达载体pEGFP-L60V,转染人肝胚瘤细胞株 HepG2细胞,荧光显微镜及Western blot 法检测其在细胞中的表达；并以 RT-PCR 及Western blot法检测JAK-STAT信号转导途径分子及抗病毒蛋白表达。结果经酶切和测序分析,成功构建HBc突变体L60V重组质粒；将L60V和HBc野生株表达质粒( pEG-FP-WT)分别转染 HepG2细胞后,以1000 IU/ml IFN-α处理,转染L60V和HBc野生株表达质粒的细胞内抗黏液病毒A(MxA)及 JAK-STAT 信号转导途径分子 STAT1、STAT2、IRF9表达减少,其中在转染 pEGFP-L60V 细胞内的 MxA、STAT1、STAT2和IRF9表达显著减少。结论HBc突变体L60V可能通过 JAK-STAT 信号转导途径抑制抗病毒蛋白MxA的表达来拮抗IFN-α的抗病毒作用；其拮抗IFN-α抗病毒作用比HBc更显著。
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牛丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6同源基因的克隆化研究
目的利用不同种属动物之间重要基因序列高度同源的理论,应用生物信息学技术和方法,克隆牛丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)的同源基因.方法首先应用酵母双杂交技术,以表达HCV核心蛋白的表达载体为诱饵,对于百万级的肝细胞cDNA文库酵母进行配合、筛选,首先获得人HCBP6的全长编码基因,然后应用美国国立生物信息学中心(NCBI)建立的核苷酸序列数据库(GenBank)的同源基因的检索,搜索与之同源的来源于牛的表达序列标签(EST).然后根据基因同源性的原则,确定牛HCBP6的同源基因.结果获得了与HCV核心蛋白结合蛋白的36个基因片段,其中之一命名为HCBP6.根据基因同源性搜索,获得了来源于牛的EST基因序列片段,终确立了牛HCBP6的同源基因.结论利用不同物种之间基因同源性的原理,NCBI数据库GenBank同源基因的搜索,获得了牛HCBP6同源基因.生物信息学技术在后基因组时代具有重要地位和作用.
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丙型肝炎病毒1b型核心蛋白和NS4B蛋白与肝癌形成的关系研究进展
目前,全世界丙型肝炎的感染率为3%,估计约有1.7亿人感染丙型肝炎病毒(HCV),每年新发病例约3.5万例,在我国一般人群中抗HCV的阳性率为3.2%,丙型肝炎患者约4 000万,丙型肝炎病毒是导致慢性肝炎、肝硬化和肝细胞肝癌的主要原因之一.
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低病毒载量时丙型肝炎病毒基因分型研究
目的 探讨丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)低病毒载量时,HCV核心蛋白(Core)和Core/包膜蛋白1(envelope protein 1,E1)区直接测序法对HCV基因分型的影响.方法 HCV-RNA 103～＜ 104拷贝/mL患者30例,采集其血清标本,采用巢式PCR对Core和Core/E1区分别扩增,产物直接测序,构建进化树进行基因分型.结果 Core区扩增阳性25例(83.3％),其中1b型15例,2a型5例,3a型2例和6a型3例;Core/E1区扩增阳性19例(63.3％),其中1b型11例,2a型4例,3a型2例和6a型2例.结论 当HCV-RNA载量较低时,Core区较Core/E1区有较高扩增效率和准确性,是临床或科研中应用直接测序法对HCV基因分型较理想的基因区.
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丙肝病毒核心蛋白抑制乙肝病毒复制的研究
目的 探讨丙肝病毒(HCV)核心蛋白(Core)对乙肝病毒(HBV)复制的影响,并探讨其调节机制.方法 将Core蛋白真核表达载体Flag2B-Core、HBV感染性克隆pHBV1.3及其启动子pHBV-Luc分别转染HepG2和HepG2.2.15细胞;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg含量;荧光定量PCR法检测细胞闭合环状DNA(cccDNA);Luminometer荧光检测仪检测HBV启动子活性.结果 随着HCV Core蛋白浓度的不断增加,HepG2.2.15细胞上清中的HBsAg和HBeAg表达逐渐降低,0.0 μg组、0.5 μg组均显著高于1.0 μg组、2.0 μg组(P＜0.05);HepG2.2.15细胞内HBV cccDNA含量亦逐渐降低,并呈剂量依赖效应;HepG2细胞荧光素酶的活性不断降低,0.0 μg组、0.5μg组均显著高于1.0 μg组、2.0 μg组(P＜0.05),Core蛋白下调HBV启动子活性呈剂量依赖效应,Spearman相关分析显示两者相关性良好(P＜0.01).结论 HCV Core蛋白在细胞水平抑制HBV的复制.
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丙型肝炎病毒调节白介素32表达的分子机制研究
目的 探讨丙型肝炎病毒(HCV)调节白细胞介素32(IL-32)表达的分子机制.方法 将HCV单个基因的表达质粒(pCMV-core、pCMV-p7、pCMV-E1、pCMV-E2、pCMV-NS2、pCMV-NS3、pCMV-NS4A、pCMV-NS4B、pCMV-NS5A、pCMV-NS5B)分别与IL-32基因启动子共转染Huh7.5.1细胞,并测定荧光素酶的活性.采用荧光定量PCR检测IL-32细胞内mRNA的表达情况,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清中IL-32的含量.结果 HCV核心蛋白(core)能够在Huh7.5.1细胞中上调IL-32基因启动子的活性,上调倍数为4.51倍;而且随着HCV core基因的含量不断增加,其调节作用不断增强.与对照组相比,转染core基因后Huh7.5.1细胞的IL-32 mRNA上调3.86倍,细胞上清中IL-32的含量亦明显升高.结论 HCV在Huh7.5.1细胞通过core基因上调IL-32的合成和分泌.
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外源HCV核心基因表达载体在HepG2中蛋白表达的亚细胞定位
目的 研究HCV全长(天然)核心蛋白(C蛋白)和成熟C蛋白在HepG2细胞内的亚细胞定位,为进一步研究C蛋白与宿主细胞蛋白因子相互作用提供实验依据.方法 设计HCV全长和成熟核心基因引物,以pBRTM/HCV1-3011为真核表达载体为模版行PCR;将PCR扩增产物酶切纯化后定向插入pEGFP-C1的BeglⅡ和EcoR Ⅰ位点,得到能表达全长HCV核心蛋白(C191 aa.)和成熟核心蛋白(C173 aa.)的真核表达载体pEGFP-C1-C191、pEGFP-C1-C173;将扩增pEGFP-C1-C191、pEGFP-C1-C173质粒转染到HepG2细胞中,28 h、5 d在荧光显微镜下观察两种C蛋白的亚细胞定位.5 d后再用免疫细胞化学法观察两种C蛋白在HepG2细胞中着色现象.结果 HCV核心基因PCR产物和构建的pEGFP-C1-C191、pEGFP-C1-C173经扩增测序证实.pEGDP-C1-C191转染HepG2细胞28 h后融合荧光全长C蛋白C191主要出现在核膜和胞质中,少部分出现在胞核及其膜中;而pEGDP-C1-C173转染HepG2细胞28 h后主要定位在核中和核膜上.但pEGDP-C1-C191转染HepG2细胞5 d后,其表达的融合荧光蛋白主要出现在核内和核膜上,少量在胞质中;而成熟C蛋白C173则仍然在胞核内及核膜上.pEGDP-C1-C转染HepG2细胞5 d后进行免疫细胞化学显示,C191蛋白和C173蛋白主要在核中、核膜着色,胞质有少量着色.结论 HCV全长C蛋白的亚细胞定位是一动态过程,先出现在胞质中和核膜上,后定位在核中和核膜上;成熟C蛋白主要定位在核中和核膜上.这种现象为解释瞬时转染HCV不同长度C基因对p53/p21通路作用出现相反结果奠定基础.
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HCC和HepG2细胞表达HCV C蛋白、p14ARF、p21WAF1的意义探讨
目的 检测HCV C蛋白、p14、p21在HCC和表达野生p53 HepG2中的表达,初步探讨C蛋白在HCC和HepG2中对p14-p53-p21凋亡通路的作用.方法 收集42例HCC石蜡组织,采用免疫组织化学EnVision法检测HCC组织中核心蛋白、p14和p21的表达,用统计学方法及临床联系分析它们之间的关系;用细胞化学EnVision法和免疫荧光法检测核心蛋白、p53、p14和p24在HepG2细胞中的表达.结果 C蛋白、p14和p21的阳性表达主要定位于细胞核膜和细胞核中;HCC组织中C蛋白、p14和p21阳性率分别为40.5%、45.24%、19.05%;3组间的Kruskal-Wallis检验P=0.03,差异显著;C蛋白与p14、p21间及p14与P21间蛋白阳性强度相关性分析显示,P值分别为0.000、0.43、-0.34,相关系数rs分别为0.64、-0.29、-0.33.HepG2细胞有较高的C蛋白和P53表达及少量的p14、p21蛋白表达.结论 在C蛋白阳性的HCC中p14的表达与C蛋白有关,HCC中p21表达缺陷是十分常见的;C蛋白在HCC中可能影响p53通路,下调p21的表达,阻止其凋亡作用;HepG2细胞永生化特性可能与HCV或HCV C蛋白有关.
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中国株HIV-1核心蛋白真核表达载体的构建与表达
运用限制性内切酶XbaⅠ、SalⅠ对pKSGAG进行双酶切,获得HIV-1 gag基因,并与真核表达载体pCI-neo连接,构建含有中国流行株HIV-1 核心蛋白真核表达载体pCI-neoGAG.经XbaⅠ/SalⅠ双酶切及测序鉴定证实,成功地构建了HIV-1 核心蛋白真核表达载体pCI-neoGAG.通过脂质体将pCI-neoGAG转染入p815细胞,G418筛选4周后,使用间接免疫荧光方法检测表达产物.结果表明所构建的HIV-1 核心蛋白真核表达载体能在p815细胞中高效表达,为下一步进行HIV-1 DNA疫苗研究奠定了基础.
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HCV核心蛋白诱导Cos-7细胞凋亡
将丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(Core)基因的全长序列插入到真核表达载体pCDNA3 CMV启动子下游,构建真核表达载体pCDNA3-Core,用脂质体LipoVecTM转染Cos-7细胞系进行瞬时表达;DNA转染24h后用免疫斑点试验检测在细胞中表达的Core蛋白;转染72h后用Hoechst染色和DNA Ladder检测Cos-7细胞的凋亡情况;荧光染色观察到了细胞凋亡核碎裂,琼脂糖凝胶电泳也呈现出180-200bp整数倍的梯形带,呈现典型的细胞凋亡特征.这些结果表明HCV Core蛋白的表达能引起Cos-7细胞凋亡,Core蛋白的这种功能可能在HCV的持续感染过程中起着一定的作用.
