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PCR法制备地高辛标记DNA探针斑点杂交检测副溶血性弧菌tlh基因
目的 建立检测副溶血性弧菌种特异性tlh基因的斑点杂交方法.方法 采用PCR法制备地高辛标记DNA探针,建立斑点杂交条件.杂交反应条件优化如下:杂交温度65℃,杂交时间9～12 h,探针使用浓度100～125 pg/ml.结果 地高辛标记tlh基因探针长度为450 bp,标记产量为50 μg/ml.探针具有较高的灵敏度和特异性,可重复使用4次.结论 本方法具有快速、简便、高效的特点,适用于副溶血性弧菌菌株的鉴定.
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应用SYBR Green Ⅰ荧光PCR快速检测副溶血弧菌及其毒力基因
目的 利用SYBR Green Ⅰ荧光PCR反应检测副溶血弧菌及其trh和tdh毒力基因.方法 根据副溶血弧菌tlh基因设计引物,建立检测副溶血弧菌SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法,利用33株副溶血弧菌分离株以及22株其他种属细菌进行特异性和灵敏度评价.根据副溶血弧菌trh和tdh毒力基因序列设计引物,建立检测副溶血弧菌毒力基因的单重和双重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法,并对这两种方法进行特异性和灵敏度评价.结果 本研究中基于tlh基因的荧光PCR检测对全部33株副溶血弧菌检测为阳性,检测下限为5×101拷贝/μl,而22株其他种属细菌均为阴性.毒力基因trh和tdh均能特异性检测,其单重荧光PCR检测下限为5×101拷贝/μl,双重荧光PCR检测下限为5×102拷贝/μl.结论 本研究建立了tlh作为靶基因检测副溶血弧菌的单重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法和同时检测副溶血弧菌trh和tdh毒力基因的双重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法,简化了毒力基因检测,有良好的实际应用前景.
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福建不同来源副溶血性弧菌的毒力因子检测
目的 了解福建省不同来源副溶血性弧菌携带毒力因子情况,为副溶血性弧菌食物中毒的检测和研究提供参考依据.方法 用PCR方法检测从食品及食物中毒病人分离菌株的毒力因子.结果 食品和临床病人分离菌株均含t/h基因,不含trh基因;临床分离菌株均含tdh基因,而食品分离菌株均不含tdh基因或含量少.结论 福建省副溶血性弧菌食物中毒与副溶血性弧菌的tdh基因有关,tdh基因可作为副溶血性弧菌致病性的特异性检测项目.
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副溶血弧菌tlh基因的克隆及序列分析
目的构建副溶血弧菌不耐热性溶血毒素(thermolabile hemolysin,TLH)tlh基因重组质粒.方法根据已知GenBank中的tlh基因序列,设计合成一对引物,用PCR方法从副溶血弧菌基因组DNA中扩增编码TLH的基因片段,克隆至pET32a+质粒,转化大肠杆菌DH5 感受态细胞,经酶切及PCR鉴定,而后进行测序.结果tlh基因体外扩增产物大小约1300bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,测序结果与已知序列基本吻合.结论在国内首次克隆了副溶血弧菌tlh基因,为研究TLH的功能和探讨TLH作为作为特异性诊断靶抗原的研究奠定了基础.
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环介导等温核酸扩增法快速检测副溶血性弧菌的研究
目的 基于环介导等温核酸扩增法(LAMP)建立副溶血性弧菌tlh基因的快速检测方法.方法 以副溶血性弧菌tlh基因为扩增的靶序列分别设计外引物、内引物和环引物各1对,通过引物特异性识别tlh基因上的6个独立区域在恒温条件下扩增靶序列,快速检测副溶血性弧菌.并对该法进行灵敏度、特异度试验,将该方法与荧光定量PCR法检出率进行统计学比较.结果 LAMP法低检出限为10· fg/μl,灵敏度是荧光定量PCR的10倍;特异度实验中除检出2株副溶血性弧菌外,6株非副溶血性弧菌均未检出;LAMP法与荧光定量PCR法检出率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 LAMP法具有高特异性、高效性、快速简便易检测等特点,适合现场快速检测,在食物中毒暴发处置中有深远的经济价值.
关键词： 副溶血性弧菌 tlh基因 环介导等温核酸扩增法
