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血清-葡萄糖剥夺抑制热休克蛋白90致心肌细胞损伤
目的 探讨热休克蛋白90(HSP90)表达下调是否参与血清-葡萄糖剥夺(SGD)引起的心肌细胞损伤.方法 用血清-葡萄糖剥夺处理H9c2心肌细胞,建立缺血性心肌细胞损伤的体外模型;在血清-葡萄糖剥夺处理前,应用HSP90选择性抑制剂17-AAG预处理心肌细胞60 min;CCK-8比色法检测细胞存活率;Fluo-3AM染色结合荧光显微镜照相术检测细胞内游离钙水平;Western blot检测HSP90和葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的表达.结果 血清-葡萄糖剥夺处理24h可明显抑制H9c2心肌细胞内HSP90的表达,诱导细胞内钙超载及上调内质网应激蛋白GRP78的表达.选择性HSP90抑制剂17-AAG预处理不仅可以加重血清-葡萄糖剥夺引起的心肌细胞存活率降低,而且进一步加重血清-葡萄糖剥夺引起的H9c2心肌细胞内钙超载及内质网应激蛋白GRP78的表达上调.结论 抑制HSP90可能是血清-葡萄糖剥夺损伤心肌细胞的重要机制之一.
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依达拉奉保护H9c2心肌细胞对抗化学性低氧引起的损伤
目的 探讨新型的自由基清除剂依达拉奉(EDA)能否保护H9c2心肌细胞对抗化学性低氧引起的损伤.方法 应用化学性低氧模拟剂氯化钴( CoCl2)处理H9c2心肌细胞以建立化学性低氧损伤模型.应用CCK-8比色法检测细胞存活率；Hoechst 33258核染色法检测凋亡细胞的形态学及数量变化；双氯荧光素(DCFH-DA)染色荧光显微镜照像测定细胞内活性氧(ROS)水平；JC-1染色荧光显微镜照像检测线粒体膜电位(MMP).结果 应用100～1000 μmol/L CoCl2处理H9c2心肌细胞24h,呈浓度依赖性地降低细胞存活率；在12 ～36 h范围内,800μmol/L CoCl2呈时间依赖性地抑制细胞存活率；10 ～40 μmol/L EDA或500～2000 μmol/L N-乙酰半胱氨酸(NAC,为ROS的清除剂)预处理H9c2心肌细胞1h呈浓度依赖性地对抗CoCl2对细胞存活率的抑制作用；在800 μmol/L CoCl2处理H9c2心肌细胞前1h,应用40 μmol/L EDA预处理细胞不仅可明显的抑制CoCl2诱导的细胞内ROS生成增多,还能抑制CoCl2的致细胞凋亡作用及MMP的损伤作用.结论 EDA能保护心肌细胞对抗CoCl2诱导的损伤作用,此心肌细胞保护作用可能与其抗氧化作用及保护MMP有关.
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组蛋白乙酰化/去乙酰化失衡对平面细胞极性途径关键基因影响的研究
目的 观察组蛋白乙酰化/去乙酰化失衡对胎鼠心脏的致畸作用及对H9C2心肌细胞平面细胞极性(PCP)途径关键基因Vangl2、Scrib、Rac1表达的影响.方法 将40只C57/B6孕小鼠随机分为空白对照组(n=10)、溶剂对照组(n=10)和丙戊酸(VPA)组(n=20);应用组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂VPA单次剂量700 mg/kg腹腔注射妊娠第10.5天(E10.5 d)VPA组孕鼠,溶剂对照组孕鼠腹腔注射等量生理盐水,空白对照组不做任何处理.于E15.5 d处死孕鼠,统计死胎率;取活胎鼠心脏行苏木精-伊红(HE)染色,观察VPA对胎鼠心脏的致畸作用.培养H9C2心肌细胞并将其分为空白对照组、溶剂对照组和VPA组,VPA组以不同浓度(2.0、4.0、8.0 mmol/L)作用于H9C2心肌细胞,溶剂对照组加入等量生理盐水,空白对照组不进行任何处理.实时荧光定量PCR和Western blot检测HDAC1~3及Vangl2、Scrib、Rac1基因在VPA干预后24、48、72 h mRNA及其蛋白表达水平;比色法测定总HDAC活性变化.结果 VPA组胎鼠死亡率为31.7%,心脏畸形发生率显著高于两对照组(P<0.05).与两对照组相比,不同浓度VPA干预后各时间点,HDAC1 mRNA表达水平均显著升高(P<0.05),而蛋白表达水平于48 h及72 h显著降低(P<0.05);不同浓度VPA干预后,HDAC2 mRNA仅在24 h表达显著下降(P<0.05),而蛋白表达水平在各时间点均显著下调(P<0.05);HDAC3 mRNA在VPA(4.0 mmol/L、8.0 mmol/L)干预的各时间点均表达增高(P<0.05),而蛋白表达水平在不同浓度VPA干预后各时间点均下调(P<0.05).与两对照组相比,不同浓度VPA干预后,Vangl2、Scrib mRNA及其蛋白表达水平在48 h、72 h均显著下降(P<0.05),Vangl2蛋白表达仅在72 h降低(P<0.05).与两对照组相比,VPA(4.0及8.0 mmol/L)干预后24 h,总HDAC活性显著降低(P<0.05);干预后48 h、72 h,不同浓度VPA组总HDAC活性均明显降低(P<0.05).结论 VPA可能通过直接抑制HDAC1~3蛋白表达水平及总HDAC活性致乙酰化/去乙酰化失衡,从而导致PCP途径关键分子Vangl2、Scrib mRNA及蛋白表达水平下调,这可能是先天性心脏病发生的机制之一.
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肉苁蓉苯乙醇苷拮抗H2O2诱发H9c2细胞内质网应激损伤的保护作用
目的 使用肉苁蓉苯乙醇苷(PhG-RE)对H9c2心肌细胞预处理,观察其在H2O2诱导心肌细胞内质网应激损伤(ERS)过程中的保护作用.方法 CCK-8法检测细胞存活率;分光光度法检测乳酸脱氢酶(LDH)释放量;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率;RT-qPCR测定细胞内质网应激相关基因GRP78、CHOP、JNK及caspase-12的mRNA表达.结果 使用H2O2及内质网应激激活剂毒胡萝卜素(TG)处理细胞可降低细胞存活率,加重凋亡(P＜0.01),LDH释放升高(P＜0.01),GRP78、CHOP、caspase-12等mRNA表达显著升高(P＜0.01),JNK mRNA表达升高(P＜0.05);使用PhG-RE及内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)对心肌细胞进行预处理,可降低H2O2诱导的细胞凋亡,提高存活率(P＜0.01),减少LDH释放(P＜0.01),降低GRP78、CHOP、caspase-12等mRNA表达(P＜0.01);使用PhG-RE预处理可改善TG诱导的细胞凋亡,提高存活率(P＜0.01),减少LDH释放(P＜0.01),降低GRP78、JNK、caspase-12的mRNA表达(P＜0.01).结论 PhG-RE能够改善由H2O2诱导内质网应激损伤引起的H9c2细胞损伤及凋亡,且可能与调节内质网应激损失相关GRP78、CHOP、JNK及caspase-12mRNA等表达有关.
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丹酚酸B对缺氧复氧诱导H9c2心肌细胞损伤的保护作用机制研究
目的 观察丹酚酸B(Sal B)对H9c2心肌细胞缺氧复氧(hypoxia-reoxygenation,H/R)损伤的保护作用,并探讨其可能的作用机制.方法 首先构建H9c2心肌细胞缺氧复氧模型,采用噻唑蓝(MTT)法研究丹酚酸B与H9c2心肌细胞活力的量效关系,确定丹酚酸B的保护作用,给药方式为预给药.实验分为正常对照组、丹酚酸B组、模型组(H/R组)、H/R+丹酚酸B组,分别检测各组乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、活性氧簇(ROS)以及半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Caspase-3)的含量变化.Western印迹检测添加丹酚酸B对Akt磷酸化的影响,添加Akt抑制剂LY294002加以比较.结果 与正常对照组相比较,模型组LDH、MDA、ROS以及Caspase-3含量水平显著升高(P<0.05),SOD、GSH-Px以及CAT含量水平显著降低(P<0.05);与模型组相比,丹酚酸B能够显著提高SOD、GSH-Px以及CAT含量水平(P<0.05),显著降低LDH、MDA、ROS以及Caspase-3含量水平(P<0.05).Western印迹结果显示与正常对照组相比较,模型组Akt磷酸化水平显著降低(P<0.001),相对于模型组丹酚酸B能够显著提高Akt的磷酸化水平(P<0.01),而这种保护作用能被LY294002所阻断(P<0.01).结论 丹酚酸B对H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤具有保护作用,其机制可能与磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K/Akt)通路相关.
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FGF-1对TGF-β1诱导的H9c2心肌细胞凋亡与Caspase-3,Caspase-8和Caspase-9表达的关系研究
目的 观察酸性成纤维细胞生长因子(FGF-1)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的H9c2心肌细胞凋亡作用及对半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3),半胱氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)和半胱氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)表达的影响,并探讨可能机制.方法 体外培养H9c2细胞,随机分为5组:模型组,肝素(Heparin)组、FGF-1组、FGF-1/Heparin组和正常对照组.采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)比色分析检测H9c2细胞的存活率,TUNEL染色检测H9c2细胞凋亡指数和Western blot分析检测H9c2细胞Caspase-3,Caspase-8和Caspase-9的表达.结果 模型组H9c2细胞存活率与正常对照组比较,差异有统计学意义(P <0.05),模型组降低;FGF-1组和FGF-1/Heparin组H9c2细胞存活率与模型组比较,差异有统计学意义(P <0.05),FGF-1组和FGF-1/Heparin组均升高.模型组H9c2细胞凋亡指数,Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表达与正常对照组比较,差异有统计学意义(P <0.05),模型组升高;FGF-1组和FGF-1/Heparin组H9c2细胞凋亡指数,Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表达与模型组比较,差异有统计学意义(P <0.05),FGF-1组和FGF-1/Heparin组降低.结论 FGF-1对TGF-β1诱导的H9c2心肌细胞凋亡具有抑制作用,其机制可能与抑制Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表达有关.
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二甲基甲酰胺致H9c2心肌细胞炎性损伤研究
目的 探讨二甲基甲酰胺(DMF)对H9c2心肌细胞炎性损伤的影响及其可能的机制.方法 取离体培养H9c2心肌细胞,设对照组和50、100、200 mmol/L组,分别予浓度为0、50、100、200 mmol/L DMF处理12 h;设对照组和2、4、6、8、12 h组,分别予浓度为200 mmol/L DMF处理0、2、4、6、8、12 h.以比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)活力,紫外分光光度法检测肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)活力,酶联免疫吸附法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8水平,荧光探针法检测活性氧水平,免疫荧光细胞化学(IFC)法检测核转录因子-κB(NF-κB)p65蛋白定位.结果 与对照组比较,50、100、200 mmol/L组细胞LDH、CK和CK-MB活力均升高(P<0.05),均呈剂量-效应关系(P<0.01);6、8、12 h组细胞LDH、CK和CK-MB活力均升高(P<0.01),呈时间-效应关系(P<0.01).与对照组比较,200 mmol/L组细胞TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平均升高(P<0.05),4和12 h组细胞TNF-α水平均升高(P<0.05),2、4、6、8和12 h组细胞IL-1β水平均升高(P<0.05),2和4 h组细胞IL-6水平均升高(P<0.05),2 h组细胞IL-8水平升高(P<0.05);且TNF-α、IL-1β和IL-6水平在4 h组达到高峰,IL-8水平在2 h组达到高峰.2、4和6 h组细胞内活性氧水平均高于对照组(P<0.05);活性氧水平在2 h组达到高峰.IFC法对细胞内NF-κB p65蛋白定位显示,染毒后2、4 h组细胞核内p65蛋白荧光强度较对照组增强.结论 DMF对H9c2心肌细胞造成炎性损伤,且活性氧和NF-κB可能参与炎性损伤过程.
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自噬在乌头碱诱导H9C2心肌细胞凋亡中的作用及机制研究
目的:观察自噬在乌头碱诱导H9C2心肌细胞凋亡中的作用,并对其作用机制进行初步探讨.方法:以0.05％、0.1％、0.2％、0.4％浓度的乌头碱分别对H9C2心肌细胞作用30、60、90、180 min,采用MTT法测定乌头碱对H9C2心肌细胞的增殖抑制作用;0.05％乌头碱作用H9C2心肌细胞不同时间后,应用MDC荧光染色观察自噬的发生,Hoechst 33342/PI荧光双染观察凋亡的发生;并通过Western blot法检测自噬相关蛋白LC3B、Beclin-1和凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax表达的变化.结果:乌头碱对H9C2心肌细胞增殖有显著的抑制作用,且该作用呈时间及浓度依赖性;MDC荧光染色和Hoechst 33342/PI双染检测结果显示乌头碱给药后可诱导H9C2心肌细胞发生自噬和凋亡;Western blot检测结果显示,自噬特异性蛋白LC3B和Beclin-1被激活,凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达升高.用3-MA抑制自噬后,可下调LC3B、Beclin-1、Bcl-2蛋白表达,上调Bax蛋白表达.结论:乌头碱能抑制H9C2心肌细胞的生长,并诱导其发生自噬和凋亡,此过程中自噬和凋亡可能为拮抗作用,3-MA特异性抑制自噬后可增加乌头碱诱导的H9C2心肌细胞凋亡.
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山楂中有机酸对H2O2诱导H9C2心肌细胞损伤的保护作用
目的:探讨山楂中有机酸对H2O2诱导H9C2心肌细胞损伤的保护作用及机制.方法:将对数期生长的H9C2心肌细胞随机分为6组:空白对照组、模型组、NAC阳性对照组和山楂有机酸(浓度分别为6.25、25、100μg/mL)组.心肌细胞在100 μg/mL H2O2作用2h后,采用MTT法检测细胞增殖,利用试剂盒测定细胞外液LDH漏出量和GSH-Px活性及细胞内SOD、MDA水平.对心肌细胞进行HE染色,用光学显微镜观察细胞形态变化.结果:与模型组比较,山楂有机酸可促进H9C2心肌细胞增殖,使LDH漏出量和MDA含量显著降低,SOD和GSH-Px活性显著升高(P＜0.05～P＜0.001),并能明显抑制H2O2引起的心肌细胞形态改变.结论:山楂有机酸对H2O2诱导的H9C2心肌细胞损伤具有保护作用,作用机制可能和有效地改善细胞内抗氧化酶的活性,抑制氧化应激损伤有关.
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荭草花提取物对H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用
目的:探究荭草花提取物对H9e2心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用.方法:利用氯化钴(CoCl2)建立缺氧复氧损伤H9c2细胞模型,实验分正常对照组、模型组及荭草花提取物不同浓度组.应用MTS检测细胞存活率;生化试剂盒检测细胞乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)释放量及细胞内丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)水平;Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡情况;Western blot测定cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达.结果:利用800μmol/L CoCl2缺氧22 h,复氧2h可建立缺氧复氧损伤心肌细胞模型.与模型组比较,荭草花提取物能显著升高心肌细胞存活率,降低LDH、CK释放量及细胞内MDA含量,提高细胞内SOD、CAT活性,并呈浓度依赖性抑制CoCl2诱导的缺氧复氧损伤.荭草花提取物能下调促凋亡蛋白cleaved Caspase-3、Bax的表达,上调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达,减少心肌细胞凋亡.结论:荭草花提取物对心肌细胞缺氧复氧损伤具有一定的保护作用,其机制可能与增强细胞清除自由基能力及抑制细胞凋亡有关.
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山核桃叶总黄酮对H9C2心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用
目的:研究山核桃叶总黄酮对H9C2心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用.方法:体外培养大鼠H9C2心肌细胞,用不同浓度氯化钴并优化不同缺氧及复氧时间建立缺氧复氧损伤模型.缺氧复氧前加入终浓度为2.5、5、10 μg/mL的山核桃叶总黄酮预处理,通过检测细胞上清液中LDH释放量,细胞内MDA含量和SOD活性;并采用MTS检测缺氧复氧损伤后细胞的成活率以及Hoechst-PI双染和流式细胞术观察细胞凋亡情况,蛋白免疫印迹检测细胞内HIF-1α蛋白表达,来考察山核桃叶总黄酮保护心肌细胞缺氧复氧损伤的作用.结果:利用1 200 μmol/L氯化钴缺氧18h,复氧2h可建立缺氧损伤心肌细胞模型.与模型组比较,山核桃叶总黄酮能降低H9C2细胞缺氧复氧损伤后LDH释放量及细胞内MDA含量,提高SOD活性,减少细胞凋亡,并使细胞HIF-1α蛋白表达恢复正常水平.结论:山核桃叶总黄酮对心肌细胞缺氧复氧损伤具有一定的保护作用,其机制可能与抗氧化、增强细胞清除自由基能力、减少脂质过氧化物产生及抑制细胞凋亡有关.
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血管紧张素-(1-7)通过抑制活性氧激活的环氧合酶-2通路保护心肌细胞对抗高糖引起的损伤
目的 探讨活性氧(ROS)激活的环氧合酶-2(COX-2)通路在高糖(HG)损伤H9c2心肌细胞中的作用及血管紧张素-(1-7) [Ang-(1-7)]能否通过调控ROS激活的COX-2通路抑制HG引起的心肌细胞损伤.方法 应用Western blot法检测COX-2蛋白的表达;细胞计数盒(CCK-8)测定细胞存活率;Hoechst 33258核染色检测凋亡细胞的形态及数量的变化;DCFH-DA染色荧光显微镜测定细胞内ROS水平;JC-1染色荧光显微镜照相测定线粒体膜电位(MMP).结果 应用1000 μmol/L ROS清除剂(N-乙酰半胱氨酸,NAC)或1μmol/L Ang-(1-7)共处理H9c2心肌细胞12h能显著地抑制HG对COX-2表达的上调作用;35 mmol/L葡萄糖(HG)处理心肌细胞24 h引起明显的损伤作用,使细胞存活率和MMP降低,凋亡细胞数量及细胞内ROS生成增多;Ang-(1-7)或COX-2抑制剂(NS-398)共处理心肌细胞明显地抑制上述HG引起的损伤作用.结论 Ang-(1-7)通过抑制ROS激活COX-2通路保护心肌细胞对抗HG引起的损伤.
关键词： 血管紧张素-(1-7) 活性氧 环氧合酶-2 H9C2心肌细胞 高糖 -
毛冬青皂苷E对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响
目的 考察毛冬青皂苷E对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用,并探讨其作用机制.方法 将H9C2心肌细胞随机分为正常对照组,模型组,毛冬青皂苷E低、中、高剂量对照组(10,50,250 μg·mL-1)、毛冬青皂苷E低、中、高剂量治疗组(10,50,250 μg· mL-1).造模前24 h给予相应浓度的药物预处理,缺氧4h,复氧4h后,采用CCK-8法检测细胞存活率,DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)含量,并采用蛋白印迹法(Western Blot)检测Caspase-3和Cleaved caspase-3凋亡蛋白的表达.结果 缺氧/复氧后,与正常对照组比较,模型组细胞存活率显著降低(P＜0.05),细胞内ROS含量显著升高(P＜0.01),毛冬青皂苷E各剂量治疗组预处理后,细胞存活率增加,ROS含量降低.缺氧/复氧损伤可使Caspase-3和Cleaved caspase-3蛋白表达增加.毛冬青皂苷E各剂量治疗组预处理后,Caspase-3和Cleaved caspase-3蛋白表达均下降.结论 毛冬青皂苷E对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤具有保护作用,其机制可能与减少ROS生成,抑制凋亡相关蛋白Caspase-3和Cleaved caspase-3的表达有关.
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ACh对CoCl2化学缺氧诱导H9C2心肌细胞损伤的保护作用及其分子机制
[目的]探讨乙酰胆碱(Ach)对抗氯化钴(CoCl2)诱导H9C2心肌细胞缺氧损伤的作用及其分子机制.[方法]应用600 μmol/L CoCl2处理H9C2心肌细胞12h以建立缺氧损伤细胞模型,应用ACh 10-3 mol/L预处理8h建立心肌细胞保护模型,实验分为①空白对照组(control);②损伤模型组(CoCl2 600 μmol/L);③ACh预处理组(ACh 10-3 mol/L+ CoCl2 600 μmol/L);④α7胆碱能受体(α7nAChR)拮抗剂组:ACh+甲基牛扁碱柠檬酸盐(MLA)+ CoC12组(ACh 10-3 mol/L+ CoCl2 600 μmol/L+MLA 10-6mol/L).应用CCK-8试剂盒检测细胞存活率.双氯荧光素(DCFH-DA)染色荧光显微镜照相法检测胞内活性氧(ROS)水平.JC-1荧光显微镜照相法检测细胞线粒体膜电位水平改变.Hoechst33258核染色荧光显微镜照相法测定凋亡细胞的形态及数量的变化.Fluo4-AM荧光显微镜照相法测定细胞胞质内钙离子水平的改变.Western Blot检测Drp1、caspase-3蛋白水平.[结果]600 μmol/L CoC12处理显著损伤H9C2心肌细胞,线粒体膜电位丢失,ROS生成、细胞凋亡率、胞内钙离子显著增加(P＜ 0.001),明显上调Drp1、caspase-3表达水平(P＜0.001);应用ACh预处理可明显提高H9C2心肌细胞存活率(P＜ 0.001),ROS水平下降,线粒体膜电位丢失减少(P＜ 0.001),细胞凋亡率、胞内钙离子明显下降(P＜ 0.001),显著抑制CoCl2对Drp1、caspase-3表达的上调作用(P＜ 0.01);ACh+MLA预处理可对抗ACh上述作用过程.[结论]ACh具有保护缺氧H9C2心肌细胞的作用,其机制可能与通过激动α7nAChR抑制钙离子-Drp1通路有关.
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泛素化结蛋白在心肌细胞肥大时的表达及意义
目的：建立血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导H9c2心肌细胞肥大模型，并观察各组心肌细胞泛素化结蛋白水平的变化。方法：常规培养H9c2心肌细胞，分别以3个AngⅡ浓度组（10－8、10－7、10－6 mol／L）分别处理不同时间（0、6、12、24、48、72 h），另设一个空白对照组；BCA法测量其总蛋白含量；并测量相同面积下心肌细胞数，计算心肌细胞相对表面积；Western blot法及免疫细胞化学法检测泛素化结蛋白的表达情况。结果：AngⅡ呈时间和浓度依赖关系地诱导H9c2心肌细胞肥大，表现为细胞总蛋白含量、细胞相对表面积和泛素化结蛋白表达均较对照组显著增多（P ＜0．05），且以10－7 mol／L作用48 h为显著。结论：10－7 mol／L AngⅡ诱导H9c2心肌细胞48 h后成功建立心肌细胞肥大模型，且H9c2心肌细胞肥大后，泛素化结蛋白也明显升高。
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不同缺氧复氧损伤程度对H9c2心肌细胞自噬的影响
目的 观察不同缺氧复氧(H/R)损伤程度对H9c2大鼠心肌细胞自噬及细胞存活率的影响.方法 缺氧时将H9c2大鼠心肌细胞置于缺氧培养箱分别以0.5％胎牛血清(FBS)复合高糖(4.5 g/L)DMEM、无糖培养基、磷酸盐缓冲液(PBS)为缺氧液培养3h后置换完全培养基置于正常培养箱中培养3 h;取复氧后心肌细胞,MTT法检测各组心肌细胞存活率,MDC荧光染色后流式细胞仪检测心肌细胞自噬率,实时荧光定量PCR法检测细胞内自噬相关基因5(Atg5)mRNA的表达水平.结果 与对照(CON)组相比,各H/R模型组细胞存活率均降低(P<0.05),且0.5％FBS复合高糖DMEM、无糖培养基、PBS处理的H/R心肌细胞存活率逐渐下降;流式细胞仪与实时荧光定量PCR的结果显示,与对照CON组相比各H/R模型组心肌细胞自噬率与Atg5 mRNA的表达差异均有统计学意义(均P<0.05),且0.5％FBS复合高糖DMEM、无糖培养基、PBS处理的H/R心肌细胞自噬率与Atg5 mRNA的表达均逐渐下降,其中0.5％FBS复合高糖DMEM、无糖培养基处理的相对CON组是增加的,PBS处理的则是下降的.结论 利用缺氧培养箱可以造成H9c2大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤,细胞适度缺氧复氧可以激活细胞自噬,但细胞过分缺氧反而抑制自噬.
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银杏内酯B对H2O2诱导H9C2心肌细胞凋亡的影响
目的 观察银杏内酯B(GB)对H2O2诱导H9C2心肌细胞凋亡的影响及其机制.方法 将对数生长期的H9C2心肌细胞随机分为5组:对照组、H2O2 (200 μmol/L)干预组、GB (50、100和200 μmol/L)+H2O2(200μmol/L)干预组,每组设10个复孔.经药物干预16h后,采用MTT法检测细胞存活率;测定培养液中心肌酶(AST、CPK、LDH)活性;检测细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量;通过流式细胞仪检测细胞凋亡状况并计算凋亡率,采用RT-PCR法检测细胞中AKT mRNA、Bcl-2mRNA、Bax mRNA表达,计算Bcl-2/Bax表达比值,Western blot法检测细胞核因子-κB(NF-κB)蛋白表达并进行半定量分析,比色法检测细胞中Caspase-3、Caspase-9活性.结果 与H2O2干预组比较,GB(100、200 μmol/L)+H2O2(200 μmol/L)干预组细胞存活率显著升高(P＜0.01),培养液中AST、CPK、LDH活性显著降低(P＜ 0.05或P＜0.01),细胞中SOD、CAT活性显著升高且MDA含量显著降低(P＜0.05或P＜0.01);GB干预组细胞凋亡状况明显好转,其中GBβ(100、200 μmol/L)+H2O2(200μ.mol/L)干预组细胞凋亡率显著降低(P＜0.01),AKT mRNA和bcl-2 mRNA表达显著上调(P＜0.05或P＜ 0.01),BaxmRNA表达显著下调(P＜0.01),Bcl-2/Bax表达比值显著升高(P＜0.01),细胞中NF-kB蛋白表达量和Caspase-3、Caspase-9活性显著降低(P＜0.05或P＜0.01).结论 GB对H2O2诱导损伤H9C2心肌细胞凋亡具有抑制作用;其作用机制可能与GB能够有效改善抗氧化酶活性、降低氧化应激损伤,下调NF-κB蛋白表达,上调抗凋亡基因AKT和bcl-2表达、下调促凋亡基因Bax表达,提高Bcl-2/Bax表达比值,降低Caspase-3、Caspase-9活性有关.
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缺氧对H9C2心肌细胞中miR-19a-3p表达的研究
目的 检测大鼠H9C2心肌细胞缺氧后细胞水平和培养液中循环微小RNA(miRNA,miR)-19a-3p的表达,并探讨其与可能靶基因低密度脂蛋白受体相关蛋白2(LRP2)的关系.方法 对 H9C2心肌细胞进行缺氧(37 ℃,5% CO2,1% O2)0、4、8、12、16、20、24 h处理,采用荧光实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测其在不同时间点细胞水平和培养液中循环 miR-19a-3p的表达水平,使用ELISA、qRT-PCR、Western Blot 检测LRP2在培养液和细胞中mRNA和蛋白表达.结果 H9C2细胞培养液中miR-19a-3p的表达在缺氧0、4、8、12、16 h差异无统计学意义(P>0.05),在缺氧20 h与24 h时,H9C2细胞培养液中miR-19a-3p的表达与缺氧0 h比较,明显高表达(P<0.05);在缺氧20 h与24 h时,H9C2细胞中miR-19a-3p的表达与缺氧0 h比较,明显下降(P<0.05);H9C2细胞培养液中LRP2的表达在缺氧16 h后表达明显升高,缺氧16 h[(675.2 ± 42.4) ng/mL,n=3]、缺氧20 h[(979.4 ± 204.2)ng/mL,n=3]和缺氧24 h[(1456.0 ± 363.6)ng/mL,n=3]较0 h [(245.0 ± 10.84)ng/mL,n=3]明显升高(P<0.05);H9C2细胞中LRP2 mRNA表达水平在缺氧16 h后表达明显升高,缺氧16 h[(0.000503 ± 0.000100)ng/mL,n=3]、缺氧20 h[(0.001303 ± 0.000090)ng/mL,n=3]和缺氧24 h[(0.001617 ± 0.000110)ng/mL,n=3]较0 h[(0.0001394 ± 0.0000600)ng/mL,n=3]明显升高(P<0.05);20 h[(0.235000 ± 0.003427)ng/mL,n=3]与24 h[(0.535000 ± 0.003427)ng/mL,n=3]LRP2蛋白表达与0 h[(0.14010 ± 0.01821)ng/mL,n=3]比较,差异有统计学意义(P<0.01).结论 miR-19a-3p可能参与大鼠H9C2心肌细胞的缺氧坏死过程,并且可能通过调控LRP2而发挥作用.
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葛根素对表柔比星致H9c2心肌细胞凋亡的影响
目的：研究葛根素对表柔比星致H9c2心肌细胞凋亡的影响。方法：取H9c2心肌细胞分为空白对照组、模型组、阳性对照组（10μmol/L右丙亚胺）和葛根素低、中、高浓度组（10、50、100μmol/L），每组5个复孔。除空白对照组不作任何处理外，其他各组细胞加入表柔比星（1.0μmol/L）及相应药物，作用24 h后，采用CCK-8法检测细胞存活率，Hoechst 33258染色观察细胞的凋亡形态，流式细胞术检测细胞凋亡率，Western blot法检测凋亡相关信号蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-3的表达，比色法检测超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）的含量。结果：与空白对照组比较，模型组细胞核出现明显的凋亡小体，细胞存活率、Bcl-2表达、SOD活性均降低，凋亡率、Bax和Cleaved-caspase-3表达、Bax/Bcl-2比例、MDA含量均增加；与模型组比较，阳性对照组和葛根素中、高浓度组细胞核形态完整，细胞存活率、Bcl-2表达、SOD活性均增加，凋亡率、Bax和Cleaved-caspase-3表达、Bax/Bcl-2比例、MDA含量均降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。其余指标差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：葛根素可能通过抑制细胞凋亡信号通路和减轻氧化损伤作用来降低表柔比星的心肌毒性。
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艾塞那肽预处理对过氧化氢损伤的H9c2心肌细胞的保护作用研究
目的:研究胰高血糖素样肽1(GLP-1)类似物艾塞那肽(EX)预处理对过氧化氢损伤的H9c2心肌细胞的保护作用.方法:取体外培养的H9c2心肌细胞,分为正常对照组、模型组和0.01、0.1、1、10 nmol·L-1 EX预处理组.除正常对照组外,其余各组用过氧化氢诱导H9c2心肌细胞建立氧化应激损伤模型,EX预处理组建模前30min加入相应浓度EX,共培养6.5 h后,检测各组细胞细胞活力和培养液上清中乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性和丙二醛(MDA)含量.结果:与正常对照组比较,模型组H9c2细胞活力、SOD活性明显降低,LDH、CK-MB活性和MDA含量明显升高(P＜0.05).与模型组比较,0.1、1、10 nmol·L-1 EX预处理组细胞活力、SOD活性明显升高,LDH、CK-MB活性和MDA含量明显降低(P＜0.05),并与剂量成正相关.结论:EX预处理对H9c2心肌细胞的氧化应激损伤有保护作用,并与剂量呈正相关.
