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用简并引物快速克隆苛求芽孢杆菌尿酸酶的编码序列
目的:从头克隆苛求芽孢杆菌尿酸酶基因的编码序列.方法:据Edman降解所得N端氨基酸序列(AERTMFYGKGDV)用BLASTp搜索N端相似性＞70％细菌尿酸酶;多序列联配比对发现靠近N端和C端的2个保守肽段.据N端已知序列和2个保守肽段设计简并引物进行PCR扩增;将所得片段连接到T载体,转化后筛选阳性克隆测序.结果:据密码子偏好性调整简并引物,获得该尿酸酶从第六位氨基酸到终止密码子之间的编码序列;此尿酸酶共含322个氨基酸残基,原核尿酸酶靠近N端的保守序列ATDSMKNFI从该尿酸酶第70位氨基酸残基左右开始,另一保守序列GKVYTEPR从该尿酸酶第290位氨基酸残基开始但变为GAVFTEPR.结论:用简并引物PCR快速克隆获得了苛求芽孢杆菌尿酸酶的编码序列.
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诊断用苛求芽孢杆菌尿酸酶的剂型与储存方法
目的:考察重组苛求芽孢杆菌尿酸酶作为诊断试剂的剂型和储存方法.方法:将此重组尿酸酶制成干粉和液体剂型于-18℃和4℃储存,定期测定酶活性；在干粉制剂时加入保护剂于-18℃储存,在液体制剂时加人防腐剂于4℃储存,间隔适当时间监测酶活性.聚丙烯酰胺凝胶电泳分离此尿酸酶四聚体和二聚体,染色检测蛋白和酶活性.结果:此尿酸酶干粉和液体制剂在4℃储存28 d后对应的剩余酶活性分别为12％和100％,在-18℃冻存28 d后对应的剩余酶活性分别为24％和92％.在干粉制剂时加海藻糖、蔗糖或甘露醇作为保护剂于-18℃储存56 d后,剩余酶活性对应分别为100％、76％和43％.加叠氮钠或苯甲酸的液体制剂,在4℃储存56 d后对应的剩余酶活性分别为99％和82％.在-18℃储存至无活性的冻干粉制剂经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,发现此尿酸酶主要以无活性二聚体存在而活性四聚体很少.结论:此尿酸酶作为诊断试剂,可加入叠氮钠制成液体剂型在4℃储存.
