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FnCpf1文献资料
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新型基因组编辑蛋白FnCpf1的表达、鉴定及多克隆抗体的制备
目的:构建土拉弗朗西丝菌Novicida亚种Cpf1蛋白编码基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达、纯化重组FnCpf1蛋白后,制备兔抗FnCpf1多克隆抗体.方法:利用PCR技术扩增FnCpf1基因,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)中并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白的表达,通过镍离子金属螯合磁珠亲和纯化得到纯度较高的FnCpf1蛋白,将纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备FnCpf1多克隆抗体,并用间接ELISA法检测兔抗血清效价、Western blot鉴定其特异性.结果:扩增得到3 900 bp的目的基因片段,克隆到表达载体pET-32a(+)后,通过双酶切及测序证实pET-32a(+)-FnCpf1表达载体构建成功,可诱导表达相对分子质量160 kD的目的蛋白,经SDS-PAGE分析其为可溶性,通过镍离子金属螫合磁珠亲和纯化得到纯度为95％以上的FnCpf1蛋白,制备多克隆抗体并检测兔抗FnCpf1抗血清ELISA效价达1:512000,Western blot结果显示制备的抗体可较好地与FnCpf1蛋白特异性结合.结论:在原核系统中成功表达了FnCpf1重组蛋白,并用纯化后的蛋白制备出兔抗FnCpf1抗体,效价及特异性均良好,为进一步探讨Cpf1蛋白的生物学特性打下实验基础.
关键词： 基因编辑 CRISPR-Cas FnCpf1 多克隆抗体
