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药用植物羌活种子DNA条形码鉴定研究
基于ITS2条形码对药用植物羌活种子进行分子鉴定,以确保基原正确.该研究对药用植物羌活种子进行形态特征比较,每份样品进行3次随机取样,对每次取样的单粒种子提取基因组DNA,PCR扩增,双向测序并拼接获得ITS2序列.通过遗传距离法、建树法,并结合中药材DNA条形码鉴定系统(www.tcmbarcode.cn)进行基原鉴定.结果显示,羌活与宽叶羌活种子形态特征相似,难以明显区分.经分子鉴定,27份种子样品有24份样品为2010年版《中国药典》规定的羌活正品基原种子,包括13份羌活种子,11份宽叶羌活种子,另外3份样品不属于羌活基原植物种子.研究证明,DNA条形码技术可以准确鉴别羌活种子基原,为中药材种质资源鉴定提供了新方法,对中药材种子质量标准的建立提供依据.
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中药材锁阳的ITS2条形码分子鉴定研究
目的:应用DNA条形码技术准确、快速鉴定中药材锁阳及其混伪品.方法:采用试剂盒法提取药材的基因组DNA,PCR扩增其核糖体DNA的内转录间隔区(internal transcribed spacer 2,ITS2)并进行双向测序,应用CodonCode Aligner V3.7.1对测序峰图进行校对拼接,比较ITS2序列的GC含量,采用MEGA 5.0计算种内、种间Kimura 2-pararneter(K2P)遗传距离,通过中药材DNA条形码鉴定系统比对和构建NJ系统聚类树进行鉴定分析.结果:锁阳药材的ITS2序列长度为229 bp,种内变异较小,平均K2P遗传距离为0.003,锁阳药材及其混伪品的种间平均K2P遗传距离为0.760,种间小K2P遗传距离明显大于锁阳种内的大K2P遗传距离.中药材DNA条形码鉴定系统比对和NJ树鉴定结果均表明ITS2序列可区分锁阳及其混伪品.结论:ITS2条形码可有效鉴定中药材锁阳及其混伪品,且具有较好的稳定性和准确性,为保障临床安全用药提供了新的技术手段.
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基于熔解曲线分析技术的鹿茸药材分子鉴别
高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)是一种主要用于基因分型和突变扫描的分子诊断技术,在中药真伪鉴定中有着广泛应用前景.文章将高分辨率熔解曲线技术应用于鹿茸真伪鉴别,利用CO Ⅰ序列,在退火温度为60℃,45个循环数的条件下,建立正品鹿茸药材熔解曲线模型,并筛选确定其DNA模板浓度、引物浓度、Mg2+浓度的适宜范围.结果表明,鹿茸药材在模板DNA质量浓度为10～100 mg·L-1、引物浓度0.2 μmol·L-1,Mg2+浓度2.0 mmol·L-1的条件下,梅花鹿熔解曲线为双峰,其Tm分别为(81.96±0.07),(84.51±0.03)℃;马鹿熔解曲线为双峰,其Tm为(82.58 ±0.13),(85.95±0.05)℃.该方法可以实现简单、快速、高通量、可视化的鹿茸药材真伪鉴定.
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藏药羌活鱼的CO Ⅰ分子鉴定
对动物线粒体基因CO Ⅰ进行PCR扩增及双向测序,得到羌活鱼及其混伪品无斑肥源和截趾虎的CO Ⅰ基因序列.通过序列分析比对,根据序列差异设计特异性引物SJYW1,SJYW2,改变退火温度及循环数以得到特异性的反应条件.结果表明,当复性温度为54℃,25个循环时,正品羌活鱼在约350 bp处有明显扩增带,而无斑肥源和截趾虎没有扩增带.该实验具有较高的特异性、重复性,可用于羌活鱼的鉴别.
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基于熔解曲线分析技术的木通类药材的分子鉴别
高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)是一种主要用于基因分型和突变扫描的分子诊断技术,在中药真伪鉴定中有着广泛应用前景.该文将高分辨率熔解曲线技术应用于木通药材的鉴别,即选择trnH-psbA通用引物,在退火温度为58℃,35个循环数的条件下,建立正品木通药材的熔解曲线模型,并筛选确定其DNA模板浓度、引物浓度、Mg离子浓度的适宜范围.结果表明,在DNA质量浓度为5～125 mg·L-1、引物浓度0.4 μmol·L-1、Mg离子浓度2.0 mmol·L-1的条件下,木通药材的熔解曲线为双峰,其Tm为(81.84±0.16),(85.28 ±0.16)℃;川木通熔解曲线为单峰,其Tm为(83.22 ±0.19)℃;关木通熔解曲线为双峰,其Tm为(81.67±0.14),(84.24 ±0.10)℃.该方法可以实现简单、快速、高通量、可视化的的木通类药材的鉴定.
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黄芪与红芪SSR引物的筛选及鉴定指纹代码的构建
收集豆科SSR引物,通过分子标记技术,筛选验证可用于黄芪与红芪鉴定的核心引物.结果表明,101对SSR引物中筛选出6对有效鉴定引物,其PCR产物在相对分子质量100～500 bp,可形成的7～12条数目不等的电泳条带,其中多态性位点55个,多态性比率为100％,平均多态信息含量为0.371,多态位点建立的聚类分析(UPMGA)结果显示,获得的核心引物可在相似度为0.4处100％区分62份黄芪与红芪的混合样品,标记参试引物及对应的特征泳带,生成指纹图谱代码,为黄芪与红芪的鉴别提供依据.
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贵州白苞蒿抗肿瘤、抗氧化内生真菌的筛选与鉴定
白苞蒿Artemisia lactiflora是一种重要的药用植物.对已分离获得的54株白苞蒿内生真菌粗提物分别采用MTT法和DPPH法进行体外抗肿瘤和抗氧化活性筛选,并采用分子生物学方法对筛选出的活性内生真菌进行鉴定.结果显示,共计10株(18.5％)白苞蒿内生真菌粗提物对入骨髓白血病细胞系(HL-60)、人乳腺癌细胞系(MCF-7)和人前列腺癌细胞系(PC-3)生长的抑制活性较好,其中以链格孢属GYBH47菌株粗提物的抗肿瘤活性佳,对3种肿瘤细胞株的生长均有抑制作用;共计2株(3.7％)白苞蒿内生真菌粗提物的抗氧化活性较好,其中,拟茎点霉属GYBH42菌株粗提物同时具有抗氧化活性和细胞毒活性.表明贵州白苞蒿内生真菌是寻找有价值的生物活性成分的潜在资源,其生物活性成分值得进一步研究和开发.
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濒危兰科药用植物DNA条形码鉴定
兰科药用植物形态分类困难,此研究采用DNA条形码分子鉴定法从分子水平验证兰科药用植物的传统形态分类.以matK,psbA-trnH和ITS2序列作为DNA条形码对已进行了形态鉴定的49属135种163份兰科药用植物样品进行分子鉴定,经DNA提取,PCR扩增、双向测序及校对拼接后,将得到的序列在GenBank中进行BLAST比对,然后运用MEGA7.0软件中的Neighbor-joining(NJ)法构建物种系统进化树.结果表明,163份样品均能成功提取DNA;matK,psbA-trnH和ITS2序列的PCR扩增效率分别为100%,100%,98.77%;共获得487条序列,其中345条序列在GenBank数据库中比对到了相应物种的序列,142条为新增序列;运用NJ法构建的兰科药用植物系统进化树中,基于matK序列所构建的物种系统进化树要优于基于psbA-trnH和ITS2序列所构建的系统进化树.matK,psbA-trnH和ITS2序列在鉴定兰科药用植物过程中互为补充,DNA条形码分子鉴定法可用于辅助兰科药用植物的分类鉴定.
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荒漠植物牛心朴子内生真菌的分离与鉴定
目的:研究荒漠植物牛心朴子内生真菌类群在不同器官中分布的多样性及其与生态环境的关系,并初步筛选牛心朴子具有潜在生物活性的内生真菌.方法:采用PDA培养基,分别对陕西、宁夏野生牛心朴子内生真菌进行分离、纯化；根据菌落的形态特征并结合真菌的ITS序列进行菌株鉴定；采用稻瘟酶模型,初步筛选活性菌株..结果:从牛心朴子中共分离得到内生真菌94株,鉴定为6目9科13属9种,其中宁夏产地47株,根5株,茎14株,叶28株,鉴定为4目5科9属8种；陕西产地47株,其中根16株,茎18株,叶13株,鉴定为4目6科8属5种；18株真菌代谢产物能完全抑制稻瘟霉孢子萌发,其中N4和S17菌株的发酵液病原菌菌丝生长的抑制作用均比较强.结论:荒漠植物生心朴子内生真菌具有多样性,不同地理环境和组织类型对内生真菌的数量和种群组成存在显著差异；宁夏牛心朴子菌株分布于叶中较多,陕西牛心朴子菌株分布于茎、叶中较多；牛心朴子内生真菌具有显著的抗稻瘟菌活性.
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金银花配方颗粒的位点特异性PCR鉴别研究
中药配方颗粒已失去所有形态学辨识特征,传统鉴定方法无法有效鉴定其真伪.该文使用位点特异性PCR鉴别技术,根据金银花trnL-trnF的一个SNP位点设计特异性鉴别引物,对金银花基原植物及配方颗粒进行鉴定.经过优化DNA 提取方法后,药材与配方颗粒均成功提取到DNA,金银花基原植物及配方颗粒均可扩增获得约110 bp的条带,混伪品无条带.且BLAST结果比对证明PCR产物序列为金银花trnL-trnF序列.该文研究结果表明,DNA分子鉴定方法可弥补性状、显微鉴别局限性,对中药配方颗粒真实性进行快速准确的鉴定,为其生产、流通、用药安全提供科学依据和保障.
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一种中药精确鉴定方法——中药系统鉴定法
针对目前传统鉴定方法在中药鉴定过程中的不足(如多来源药材品种鉴定),结合分子鉴定的技术优势与特点,文章提出了一种较为精确的中药鉴定方法,中药系统鉴定法.文章介绍了中药系统鉴定法的概念、原理及方法,通过实例验证了该方法的可行性.中药系统鉴定法的提出,不仅从性状、显微、化学等“表型性状”方面揭示中药“种”的特征信息,还从其遗传物质DNA信息(基因型)的角度,更深层次的揭示“种”、“亚种”、“居群”等分类及演化关系等,为中药鉴定学科的深入发展,开拓了更广阔的研究领域.
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一种钩藤属植物的分子鉴定
目的:以核糖体转录间隔区(rDNA ITS)序列为分子标记,对1种钩藤属植物归类到种提供分子证据.方法:改良CTAB法提取钩藤植物材料总DNA,通过引物对rDNA ITS区序列进行PCR扩增,经过克隆、测序后,与GenBank中已有的钩藤属植物rDNA ITS区序列进行比对,并应用Clustal X,BioEdit等软件计算分析,用PAUP软件构建系统发育树.结果:测序得到该钩膝植物的rDNA ITS区序列长度为719bp,序列分析结果显示该钩藤植物与Genbank中已有的华钩藤Uncaria sinensis rDNA ITS区序列之间相似性达99.7%,并且在系统发育树中并排聚类成一支.结论:基于rDNA ITS区序列的测序分析和系统发育树构建的分子生物学方法,能够对该钩藤属植物进行准确的分子鉴定,为钩藤属中药材的种类鉴定和种间的分类地位提供分子生物学理论依据.
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动物药材分子鉴定研究策略
作者对动物药材分子鉴定研究的现状及问题进行了总结和分析,在此基础上,提出全国范围内相关单位联合攻关,扩大研究品种,加快动物药材分子鉴定试剂盒的研制和推广,全面启动中国动物药材DNA条形码研究计划,建立动物药材分子鉴定标准数据库等研究策略.
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中药材DNA条形码分子鉴定指导原则
随着中药材DNA条形码分子鉴定方法研究的深入与普及,国家药典委员会讨论通过在《中国药典》增补本中列入中药材DNA条形码分子鉴定指导原则,该指导原则通过对大样本量中药材进行DNA条形码分子鉴定研究,建立以ITS2为核心,psbA-trnH为辅的植物类药材DNA条形码鉴定体系和以COI为主、ITS2为辅的动物类药材DNA条形码鉴定体系.该文介绍了中药材DNA条形码分子鉴定指导原则及其起草说明,并对该原则在中药材鉴定方面的应用前景进行展望.
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基于ITS及atpB-rbcL等多片段鉴定粗壮秦艽及其近缘种
传统藏药“解吉”主要基原植物之一粗壮秦艽Gentiana robusta分布区广,且与近缘种呈同域分布现象,遗传背景复杂.多居群平行取样,直接测定该物种及其近缘物种麻花艽G.straminea、粗茎秦艽G.crassicaulis、长梗秦艽G.waltonii,外类群椭圆叶花锚Halenia eUiptica的rDNA ITS区序列及叶绿体DNA的matK,rbcL,rpoC1,trnL (UAA),psbA-trnH,atpB-rbcL,trnS(GCU)-trnG(UCC),rpl20-rps12,trnL(UAA)-trnF(GAA)序列228条;TA克隆法测定粗壮秦艽ITS区序列120条.对粗壮秦艽进行基因分型,形态学及DNA分子证据显示其可能为一杂交物种;克隆序列中寻找稳定位点,多片段组合可鉴定粗壮秦艽及其近缘种.该文对遗传背景多样的药用植物鉴定研究具有重要参考价值.
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快速PCR方法在哈蟆油真伪鉴别中的应用研究
该研究依据哈蟆油Cyt b基因155位SNP位点设计位点特异性PCR引物,采用碱裂解法提取基因组DNA,2步循环 PCR 程序进行 PCR 反应,并对PCR反应条件进行优化,从而建立起一种哈蟆油及其4种常见混伪品的快速PCR鉴别方法.该方法在90 ℃变性3 s,62 ℃退火延伸20 s进行32个循环时,加入2 μL 100×SYBR Green Ⅰ染料,正品显示出明亮绿色荧光,而混淆品不显示荧光.该方法准确、简便,40 min内即可完成鉴别,为哈蟆油药材现场快速鉴定提供技术支持.
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双阻滞位点特异性PCR鉴别铁皮石斛及其近缘物种
建立一种快速、准确鉴别铁皮石斛加工制品的方法.该研究通过对GenBank数据库收录的铁皮石斛及其同属近缘物种的ITS序列进行对比分析,根据变异位点设计双阻滞位点特异性鉴别引物,并优化PCR条件,对铁皮石斛及其69种近缘种共362个样品进行扩增和检测.结果显示,在退火温度为60℃的同一PCR反应中,铁皮石斛均扩增出397bp条带,而其他69种近缘物种均无条带,且该方法灵敏度高,检出限可达0.03mg·L-1.该文所建立的位点特异性PCR方法可实现铁皮石斛的准确鉴别,具有操作简便、稳定可靠、应用范围广的优点.
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多重位点特异性PCR鉴别人参、三七、西洋参掺杂
为建立一种能同时鉴别人参、三七、西洋参及其掺杂品的方法.通过分析人参属ITS,18S和matK序列,寻找特异性SNP位点设计引物,建立多重位点特异性PCR法,并对不同来源的人参、三七、西洋参样品进行扩增,根据特异性条带大小进行鉴别.在退火温度为60℃,循环数为35时,人参、三七和西洋参分别出现约250,500,1000 bp的特异性条带.该方法对于人参、三七、西洋参相互掺杂的混合样品,人参中掺杂三七或西洋参以及三七中掺杂西洋参或人参的检出限均为0.5％,对西洋参中掺杂人参的检出限为0.5％,掺杂三七的检出限为1％.表明建立的多重位点特异性PCR可用于人参、西洋参、三七的掺杂鉴定.
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中药穿山甲的DNA分子鉴定研究
对中药穿山甲及其混伪品进行分子鉴定研究,建立一个稳定、准确的位点特异性PCR鉴别体系.收集整理穿山甲属动物组织样本及NCBI序列,提取基因组总DNA,PCR扩增Cytb和COⅠ序列并测序,通过BioEdit软件进行序列比对,应用MEGA6.0构建序列系统聚类树,并根据序列特异位点设计和筛选中华穿山甲特异性鉴别引物,并对PCR反应条件进行退火温度、DNA模板上样量和PCR循环数等条件的适应性考查.结果表明:Cytb和COⅠ序列均能有效对穿山甲正、伪品进行聚类分析;在位点特异性PCR反应体系中,当退火温度为55~60℃,DNA模板量3~100ng,PCR扩增35个循环时,基于COⅠ序列的引物COⅠ-S10/A5能使中华穿山甲扩增出约400bp的特异性条带,而其他穿山甲品种扩增结果为阴性.该文基于COⅠ序列的引物COⅠ-S10/A5能实现中华穿山甲与伪品印度穿山甲、马来穿山甲、树穿山甲等的准确、稳定鉴别.
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名贵动物药材穿山甲的DNA条形码分子鉴定研究
利用COI序列作为DNA条形码对名贵珍稀动物药材穿山甲及其混伪品进行鉴定,为穿山甲药材分子鉴定提供科学依据.该实验采用试剂盒法提取穿山甲及其混伪品的基因组DNA,通过PCR扩增和双向测序,应用CodonCode Aligner软件进行校对拼接,采用MEGA 6.0软件对所有7个物种的56份样品进行序列比对,构建邻接(NJ)树.结果表明穿山甲药材COI序列扩增成功,所构建的NJ树结果显示穿山甲及其混伪品均可明显区分.因此,基于COI序列,应用DNA条形码技术可有效鉴定名贵动物药材穿山甲及其混伪品,为其市场监管提供了新的技术手段.
