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噬菌体展示技术应用于肿瘤的研究进展
噬菌体肽库展示技术是一种用于筛选功能性多肽的生物技术.编码多肽的外源DNA片段与噬茵体表面蛋白的编码基因重组后,以融合蛋白的形式在噬菌体表面表达出多肽序列,通过与特定的靶标反应.使展示特定蛋白的噬菌体从佑表达有各种外源性蛋白的噬茵体肽库中筛选出来,通过感染大肠杆菌使选择出的噬茵体扩增,然后进行序列测定,获得相应的结构和功能信息,实现了高通量筛选,成为一种有效的分子筛选方法.
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结合胰岛素受体的胰岛素位点研究
目的用肽库筛选技术寻找与胰岛素受体结合的胰岛素位点.方法用噬茵体随机环七肽库,与亲和于脂质体表面的鼠肝胰岛素受体亲和筛选,测定阳性噬茵体与胰岛素受体的亲和力,测定高亲和力克隆插入DNA序列,推断出融合于gⅢ蛋白末端环七肽的氨基酸残基序列.固相法选择性人工合成多肽配基YS,测定多肽YS与胰岛素受体的亲和力.比较高亲和力短肽与胰岛素的结构特征,寻找胰岛素肽链的类似结构,推断与胰岛素受体结合的胰岛素位点.结果经过三轮亲和筛选,选择12个阳性克隆测序,三种短肽YS(CYIRSLRLC)、RL(CRPLLRDRC)、MN(CNFLYGILC)出现频率高,都含有较多Leu和Arg.合成肽YS与胰岛素受体有较高亲和力,Kd值为4.31×108L/M.结论研究提示,胰岛素B链B11(Leu)、B15(Leu)是与胰岛素受体的直接结合位点.
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人结肠癌血管特异结合短肽的噬菌体肽库筛选及鉴定
目的:通过建立小鼠肾包膜下荷人结肠癌模型、利用噬菌体肽库体内筛选技术,筛选并鉴定能够与人结肠癌血管内皮细胞特异结合的噬菌体呈现短肽.方法:制备免疫抑制小鼠肾包膜F人结肠癌移植瘤动物模型.将随机环七肽库通过尾静脉注入荷瘤鼠体内,回收归巢于肿瘤组织的噬菌体,进行4轮体内筛选,随机挑取20个克隆进行测序.细胞ELISA实验初步鉴定阳性噬菌体的内皮细胞结合能力.免疫细胞化学染色鉴定阳性噬菌体克隆与共培养内皮细胞的结合能力.免疫荧光技术检测短肽与共培养内皮细胞的特异性结合能力.结果:18个克隆测序正确,它们呈现2种氨基酸序列,命名为CV1及CV2,其呈现噬菌体称为pCV1及pCV2,其中CV2/pCV2重复次数多.细胞ELISA结果显示pCV2与Co-HUVECs(与结肠癌细胞共培养的人脐静脉内皮细胞)的结合明显高于HUVECs(人脐静脉内皮细胞),有显著的差异性结合,而pCV1在Co-HIJVECs,HUVECs上结合均较少,无差异性结合.免疫荧光染色结果显示,FITC-CV2特异性结合于Co-HUVECs的胞膜与核周胞质.结论:得到两个能特异件结合于结肠癌移植瘤的噬菌体单克隆pCV1及pCV2.pCV2具有特异结合结肠癌血管的能力,有可能用于结肠癌血管靶向治疗.
