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三种重构型人caspase-8促宫颈癌HeLa细胞凋亡的效率
背景与目的:细胞凋亡是一种进化上高度保守的细胞死亡方式,将高活性的促凋亡分子靶向性地导入肿瘤细胞而诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤基因治疗的潜在策略.在证实了大、小亚基次序颠倒的重构型人caspase-8具有持续的诱导宫颈癌细胞HeLa凋亡活性的基础上,本研究旨在分析3种重构型人caspase-8(Casp8CD、Rev8和Rev8L)促HeLa细胞凋亡的效率,探讨重构型人caspase-8作为诱导肿瘤细胞凋亡候选分子的可行性.方法:脂质体法将Casp8CD、Rev8和Rev8L基因的pIRES2-EGFP真核表达载体转染入人HeLa和MCF-7细胞,用荧光显微镜观察目的基因的表达及其促凋亡效应,MTT法和细胞计数法检测3种重构型人caspase-8基因表达产物的促凋亡效率.用生物信息学方法分析Rev8和Rev8L分子大、小亚基间连接肽段的柔性.结果:荧光显微镜观察结果表明,3种重构型人caspase-8基因在HeLa和MCF-7细胞中得到表达,其中Rev8和Rev8L基因的表达能有效促进被转染细胞的凋亡,细胞表现为凋亡性容积减少(AVD).MTT结果显示,Rev8和Rev8L基因转染组在转染后20 h,A 570值即开始明显降低(与对照组相比).细胞计数结果表明,转染后24 h,Casp8CD、Rev8和Rev8L基因转染组的细胞死亡率分别为16.9%、52.3%和47.7%,而转染后48 h各组相应的细胞死亡率分别为12.9%、51.6%和61.2%.生物信息学分析结果显示,Rev8和Rev8L基因表达产物大、小亚基间的连接肽也具有较好的柔性.结论:Rev8和Rev8L分子具有相似的促细胞凋亡效应和效率,而Casp8CD基因的过表达也无明显的促HeLa细胞凋亡活性.
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重构型人caspase-8基因原核表达载体的构建及其表达
目的:构建三种重构型人caspase-8基因的原核表达载体,转染大肠杆菌并诱导其表达.方法:将人caspase-8催化结构域基因及两种大、小亚基基因次序颠倒的重构型人caspase-8基因克隆入原核表达载体pBV220,转染大肠杆菌并诱导表达.结果:成功构建了三种重构型人 caspase-8基因的原核表达载体.转染大肠杆菌后,经温度诱导,重构型人caspase-8基因获得了高效的表达.结论:在大肠杆菌中成功表达了三种重构型人caspase-8基因.
关键词： 重构型 人caspase-8基因 PBV220 原核表达
