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原发性脑瘤的分子遗传学研究进展
原发性脑瘤是发生于神经系统常见的疾病,高度恶性的胶质瘤占原发性脑瘤的40%,主要分为Ⅰ型胶质母细胞瘤(继发性胶质母细胞瘤)和Ⅱ型胶质母细胞瘤(原发性胶质母细胞瘤),二者的产生有着不同的遗传学改变.Ⅰ型胶质母细胞瘤的产生途径是从一种恶性程度较低的星形细胞瘤(Ⅱ级,主要为p53基因突变和血小板来源的生长因子/受体过表达)至恶性的间变型星型细胞瘤(Ⅲ级,主要为Rb基因突变,CDK4基因扩增,9p、11p、13q和19q的等位基因缺失),再到胶质母细胞瘤(Ⅳ级,常见的遗传学改变是7号和20号染色体的获得,10号染色体的丢失以及PTEN和LRRC4基因的缺失,PDGFα及其受体的过表达)的渐进的发展过程;而Ⅱ型胶质母细胞瘤则是一种没有恶性程度渐进过程的原发性胶质母细胞瘤,表皮生长因子受体基因的扩增是常见的遗传学改变.
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富亮氨酸重复超家族成员与脑瘤的研究进展
富亮氨酸重复(LRR)超家族成员已达4 000多种,它们在进化上保守、功能多样.许多研究表明,LRR蛋白在神经系统的发育及正常功能的维持中扮演重要角色,与脑瘤的发生发展亦存在一定的联系.LGI1,LRRC4主要分布于正常脑组织,与脑胶质瘤的恶性程度密切相关,随着胶质瘤恶性程度的增高,其表达逐渐下调甚至缺失.Slitrk,Slit及GAC1等亦参与了脑瘤的发生发展.
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LRRC4通过SDF-1α/CXCR4生物学轴抑制脑胶质瘤细胞侵袭迁移能力
目的:探讨LRRC4(leucine-rich repeats containing 4)通过SDF-1 α/CXCR4(stromal cell-derived factor-1 α/CXC receptor 4)对脑胶质瘤细胞侵袭迁移能力的影响.方法:将LRRC4基因转入脑胶质母细胞瘤U251细胞,分别通过RT-PCR实验、黏附实验、侵袭实验、细胞运动试验、划痕标记荧光染料示踪实验,研究SDF-1α干预前后LRRC4对U251细胞迁移能力的影响.结果:将LRRC4基因转入脑胶质瘤细胞U251,通过RT-PCR实验发现CXCR4的表达下调.用CXCR4的特异配体SDF-1α干预后,肿瘤黏附内皮实验、侵袭实验、细胞迁移实验、划痕标记染料示踪实验表明脑胶质瘤细胞迁移能力增强,LRRC4可以抑制细胞的这种侵袭迁移能力.SDF-1 α能够改善细胞间的通讯能力,LRRC4可以进一步增强这种通讯能力.结论:SDF-1 α/CXCR4的相互作用可以增强脑胶质瘤细胞U251的运动迁移能力,LRRC4基因可以通过调控SDF-1α/CXCR4生物学轴有效地抑制肿瘤细胞的侵袭迁移能力.
关键词： LRRC4 SDF-1α/CXCR4 脑胶质瘤 侵袭 -
LRRC4多抗制备及在构建不同级别脑胶质瘤差异表达中的应用
目的:制备兔抗脑瘤候选抑瘤基因LRRC4(leucine-rich repeats containing 4)的多克隆抗体,应用该抗体检测LRRC4表达与脑胶质瘤病理分级的相关性.方法:应用DS Gene1.1软件分析LRRC4全长蛋白,避开跨膜结构域,选取亲水性及抗原性均好的蛋白序列.构建相应的融合表达载体pGEX-4 T-2/276 bp,转入E.coli JM109中IPTG诱导表达.融合蛋白经纯化后免疫新西兰兔,收集并纯化抗血清,获得兔抗人LRRC4多抗,应用该抗体通过Western印迹和免疫组织化学检测LRRC4在正常人胚胎各器官组织中的表达及其在正常脑组织与各级脑胶质瘤中的表达差异.结果:制备了效价高、特异性好的兔抗人LRRC4多抗,进一步证实了LRRC4在正常人脑组织中相对特异高表达,在脑胶质瘤中表达下调(22例/37例)或缺失(15例/37例),其表达水平与脑胶质瘤的病理分级相关.结论:兔抗人LRRC4多抗效价高、特异性好,应用该抗体检测到LRRC4的表达水平与脑胶质瘤病理分级密切相关,为LRRC4后续的研究工作奠定了基础.
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LRRC4通过MAPK信号通路阻滞U251细胞于G0/G1期
目的:探讨脑胶质瘤抑瘤基因LRRC4通过MAPK信号通路阻滞U251细胞于G0/G1的机制.方法:通过脂质体转染法将LRRC4基因转染至U251细胞,G418筛选构建稳定转染的LRRC4/U251细胞株并验证LRRC4的阳性表达;通过Western-blot检测LRRC4对MAPK信号通路的关键分子ERK,JNK及P38的表达影响;流式细胞仪、荧光素酶活性检测分析LRRC4对U251细胞周期及细胞周期素(cyclin D1)的影响.结果:LRRC4能够下调磷酸化ERK的表达,上调总蛋白JNK2和磷酸化c-Jun的表达.LRRC4下调了U251细胞中突变型P53的表达,以及cyclin D1的启动子活性和它的表达.LRRC4的重表达将U251细胞阻滞于G0/G1期.结论:LRRC4主要通过MAPK通路的关键分子JNK2上调磷酸化的c-Jun,抑制突变型的P53的表达,进而下调cyclin D1的启动子活性和cyclin D1的表达,将U251细胞阻滞于G0/G1期.
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LRRC4基因表达能降低胶质母细胞瘤细胞系U251的生长和成瘤潜能
背景与目的:LRRC4是作者近克隆的一个新基因,该基因在原发性脑肿瘤活检标本中明显表达下调.本研究旨在研究LRRC4基因是否具有抑制脑肿瘤生长的能力.方法:LRRC4基因的全长编码区被亚克隆至表达载体pcDNA3.1中,应用脂质体转染的方法将重组的质粒载体导入胶质母细胞瘤细胞系U251,经G41 8筛选,建立稳定表达LRRC4基因的U251的细胞系.采用细胞增殖实验、软琼脂实验、肿瘤形成实验来考察LRRC4基因表达对于细胞生长和肿瘤形成的影响.结果:经过脂质体转染和筛选,建立了稳定表达LRRC4全长编码区的U251细胞系,用于进一步实验.比较未转染组和转染空白载体组,Northern blot实验证实转染了LBRC4基因的细胞LRRC4 mRNA的表达增强.细胞增殖一定时间后,转染LRRC4基因的细胞较未转染细胞的生长速度明显减慢,克隆形成率明显降低.将这些细胞注射入无胸腺裸鼠体内,40天后处死裸鼠,测量肿瘤大小,结果显示,转染LRRC4基因的细胞形成的肿瘤明显小于对照组.结论:LRRC4基因可转染于人脑胶质母细胞瘤细胞系U251.LRRC4在U251细胞的表达有抑制瘤细胞增殖和抑制裸鼠移植瘤的形成和生长的作用.
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鼻咽癌癌变前后ADAM23、MIMT1、FAM150B、GRIN2A、LRRC4甲基化研究
目的:研究鼻咽癌变前后ADAM23、MIMT1、FAM 150B、GRIN2A、LRRC4甲基化特征.方法:12例鼻咽癌10例鼻咽炎作为研究对象,抽提鼻咽组织DNA,以特异识别5-甲基胞嘧啶的抗体免疫沉淀DNA,实时荧光定量PCR分别检测5个基因含量,并设置不用5-甲基胞嘧啶抗体(非MeDIP-qPCR实验)及使用非特异性抗体IgG进行免疫沉淀作为双重对照.结果:无论鼻咽癌还是鼻咽炎患者,5个基因在使用非特异性抗体IgG实验时均未检验到甲基化,非MeDIP-qPCR实验显示5个基因在鼻咽癌及鼻咽炎荧光定量值无明显差异(P＞0.05);MeDIP-qPCR实验显示,鼻咽癌5个基因均呈现明显的甲基化,ADAM23、MIMT1、FAM 150B、GRIN2A、LRRC45在鼻咽癌校正值分别为:3.39±2.28、6.03±3.93、3.68±1.81、7.12±3.17、3.10±1.94,在鼻咽炎分别为0.00±0.00、0.01±0.01、0.25±0.49、0.20±0.20、0.00±0.00(均P＜0.01).结论:ADAM23、MIMT1、FAM 150B、GRIN2A、LRRC4 5个基因甲基化为鼻咽癌变的重要特征.
