首页 > 文献资料
-
针对 PKM2多位点 RNAi 质粒载体的构建和筛选
目的：构建针对 M2型丙酮酸激酶（ PKM2）基因3个可干扰序列设计小发夹 RNA（small hairpin RNA， shRNA）载体，为下一步探索 Ad-PKM2介导 PKM2 RNAi 对乳腺癌细胞作用及机制建立基础。方法：根据 RNAi 设计软件设计并合成3对 shRNA 模板序列，依次将它们克隆至 pGenesil 载体中构建重组质粒，通过 MTT 检测筛选出对乳腺癌细胞株 MCF-7增殖效应影响强的 RNAi 序列。结果：酶切鉴定和测序结果证实 RNAi 载体构建成功，均能高效感染 MCF-7并抑制 MCF-7细胞的增殖，pGenesil-PKM2-（1+2+3）的抑制能力强。结论：针对PKM2多靶点 RNAi 载体成功构建，为下一步研究 PKM2被沉默后细胞生物学行为的变化打下基础。
-
miR-185对肝癌细胞增殖、凋亡的影响及机制
目的：探讨 miR-185对肝癌细胞增殖、凋亡的影响及机制。方法用 Target scan human 在线软件预测miR-185调控的靶基因；采用荧光素酶报告载体系统检测 miR-185对 M2型丙酮酸激酶（PKM2）3′UTR 荧光酶活性的影响；蛋白质印迹法检测 miR-185对 PKM2蛋白表达的影响。将肝癌 HepG2细胞分为观察1组、对照1组、观察2组、对照2组、观察3组。观察1组转染 miR-185 mimics，对照1组转染 Scramble；观察2组转染 PKM2-siRNA，对照2组转染 Control-siRNA；观察3组转染 miR-185 inhibitors 与 PKM2-siRNA。采用 MTT 法检测上述5组细胞增殖能力，采用 AnnexinV-FITC 和 PI 染色法检测上述5组细胞凋亡率。结果在线预测软件发现 miR-185与 PKM2的3′UTR 有共同的结合位点，荧光素酶报告载体系统显示在 HepG2细胞中 miR-185能抑制 Wild-PKM2报告质粒组荧光素酶的活性，Western blotting 结果显示 miR-185能下调 HepG2细胞中 PKM2蛋白表达，证实 PKM2是 miR-185直接调控的靶基因；MTT 结果显示，观察1组与观察2组 HepG2细胞 OD 值分别为0．446±0．034、0．472±0．028，与对照1组（0．649±0．041）和对照2组（0．610±0．023）相比，差异均有统计学意义（P 均＜0．05）。观察3组的 OD值为0．606±0．016，与对照1组或对照2组相比，差异均无统计学意义；凋亡实验结果显示，观察1组与观察2组HepG2细胞凋亡率分别为（29．13±2．04）％、（27．46±1．95）％，对照1组、对照2组分别为（8．76±0．53）％、（8．51±0．47）％，观察1组、观察2组与对照1组、对照2组比较，P 均＜0．05。观察3组的凋亡率为（9．47±0．61）％，与对照1组或对照2组相比，差异均无统计学意义。结论 miR-185可抑制人肝癌细胞增殖并诱导细胞凋亡；机制可能是通过下调 PKM2表达实现。
关键词： 肝癌 微小 RNA-185 M2 型丙酮酸激酶 细胞增殖 细胞凋亡
