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应用SYBR荧光实时定量RT-PCR法检测TGF-β诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞中PAI-1 mRNA表达
目的 应用SYBR荧光实时定量RT-PCR法检测转化生长因子-β1(transforming growth factor betal,TGF-β1)诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts,KFs)中纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor 1,PAl-1)mRNA的表达.方法 体外分离培养KFs,应用不同浓度(1.25～20 pmol·L-1)TGF·β1刺激KFs 3 h或TGF-β1(10 pmol·L-1)刺激KFs不同时间(0.5～6 h),采用SYBR Green I荧光实时定量RT-PCR法检测,以β-actin基因作为内参,计算各组PAI-1 mRNA的相对表达量.结果 与空白对照组相比,TGF-β1能明显诱导KFs中PAI-1 mRNA的表达,10、20pmol·L-1浓度组表达比值分别增至4.19及4.44倍(P<0.01);TGF-β1(10 pmol·L-1)的1、2 h时间组表达比值分别增至2.29及2.41倍(P<0.05),3、6 h时间组分别增至4.19及5.83倍(P<0.01).提示,TGF-β1诱导KFs中PAl-1mRNA表达的适浓度为10 pmol·L-1、适时间为3 h.结论 利用SYBR荧光实时定量RT-PCR法检测TGF-β1诱导KFs中PAI-1 mRNA的表达,为进一步研究瘢痕疙瘩中TGF-β1信号通路的靶基因调控机制,以及开发治疗瘢痕疙瘩的新药提供了基础.
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实时定量测定多发性骨髓瘤中细胞周期调控蛋白D1 mRNA的表达
目的 研究多发性骨髓瘤(MM)患者细胞周期调控蛋白D1(Cyclin D1)不同水平的表达,探讨Cyclin D1在多发性骨髓瘤中的作用机制和临床意义.方法 采用荧光实时定量RT-PCR方法检测32例多发性骨髓瘤患者Cyclin D1 mRNA水平表达,其中初发未治患者19例,难治复发患者13例,良性血液病对照组20例.结果 多发性骨髓瘤组Cyclin D1mRNA表达明显高于对照组,难治复发组Cyclin D1mRNA表达水平明显高于初发未治组.结论 Cyclin D1与多发性骨髓瘤的发病有一定的关系,Cyclin D1 mRNA水平可作为评估疾病预后的指标之一及靶向治疗的靶点.
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应用SYBR荧光实时定量RT-PCR法检测BMSCs诱导大鼠肝星状细胞中DR5mRNA表达
目的 应用SYBR荧光实时定量RT-PCR法检测骨髓间充质干细胞(BMSCs)对大鼠肝星状细胞(HSCs)的死亡受体5(DR5)mRNA表达的影响,探讨BMSCs诱导HSCs凋亡及其机制.方法 采用贴壁筛选法培养、纯化SD大鼠BMSCs,传至第4代使用;大鼠原代HSCs细胞及肝纤维原细胞系冻融后传代使用.应用6孔塑料培养板,建立上下双层细胞共培养体系,常规培养.实验分为3组:(1)实验组:BMSCs与HSCs共培养;(2)空白对照组:HSCs单独培养;(3)阴性对照组:大鼠肝纤维原细胞与HSCs共培养.以上培养体系动态观察24、48、72 h,应用流式细胞仪检测HSCs细胞凋亡率,采用SYBR Green I荧光实时定量RT-PCR法检测,以β-actin基因作为内参,计算各组DR5 mRNA的相对表达量.结果 在共培养组中,BMSCs促进了HSCs凋亡,与其他两组比较差异有显著统计学意义(P<0.01),空白对照组与阴性对照组比较无统计学意义(P>0.05).实验组BMSCs能明显上调HSCs中DR5 mRNA的表达,与空白对照组和阴性对照组比较差异有显著统计学意义(P<0.01);空白对照组与阴性对照组DR5 mRNA的表达比较无统计学意义(P>0.05).结论 利用SYBR荧光实时定量RT-PCR法检测BMSCs诱导大鼠肝星状细胞中DR5 mRNA表达,为进一步研究BMSCs通过死亡受体途径调控HSCs凋亡以及为BMSCs用于治疗肝纤维化的机制研究提供了理论基础.
关键词： 骨髓间充质干细胞 肝星状细胞 DR5 凋亡 荧光实时定量RT-PCR -
实时定量RT-PCR测定急性白血病Cyclin D1 mRNA的表达
目的 研究急性白血病患者细胞周期调控蛋白D1 (Cyclin D1)不同水平的表达,探讨Cyclin D1在急性白血病中的作用机制和临床意义.方法 采用荧光实时定量RT-PCR方法检测51例急性白血病(AL)患者Cyclin D1 mRNA水平表达,良性血液病对照组16例.结果 急性白血病组Cyclin D1表达明显高于对照组;急性體系白血病(AML)与急性淋巴细胞白血病(ALL)组间Cyclin D1表达水平无显著差异性;难治复发组Cyclin D1表达水平高,初发未治组次之,完全缓解组低;初发未治组中随访的治疗后未缓解组Cyclin D1表达水平高于完全缓解组.结论 Cyclin D1与临床病情进展程度有一定的关系,尤其与病情的复发关系较为密切,动态观察患者Cyclin D1水平变化可作为评价患者治疗效果及预后的指标之一.
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慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞Tim-3表达的检测及意义
目的 研究慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血单核细胞中T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(Tim-3)的表达及对其炎症因子生成的影响.方法 利用多色流式技术和荧光实时定量PCR(qRT-PCR),分别检测不同状态的CHB患者外周血单核细胞亚群表面Tim-3分子和Tim-3 mRNA表达水平.给予重组人galectin-9和脂多糖(LPS)共刺激CHB活动期患者外周血单核细胞,用ELISA检测培养上清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平.结果 慢乙肝免疫耐受期患者(IT)外周血单核细胞表面Tim-3表达水平显著高于健康对照组(HC)和免疫活动期患者(IA)(P＜0.01),其中IT患者CD14+ CD16-和CD14+ CD16+单核细胞亚群中Tim-3的表达均高于IA患者,差异均有统计学意义.qRT-PCR结果进一步证实IA患者外周血单核细胞中Tim-3 mRNA的表达高于HC (P =0.040).IA患者CD14+单核细胞上Tim-3的表达与血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平呈正相关(r=0.362,P=0.028).重组人galectin-9和LPS共刺激IA患者外周血单核细胞比单独使用LPS刺激分泌更高水平的TNF-α,IL-1,IL-6.结论 CHB患者外周血单核细胞Tim-3表达上调,与血清ALT水平呈正相关,Tim-3/galeetin-9通路能够促进LPS诱导的单核细胞的炎症因子的分泌.
关键词： Tim-3 单核细胞 慢性乙型肝炎 荧光实时定量RT-PCR
