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GAD67-GFP基因敲入小鼠GFP与nNOS在嗅球中的表达和共存研究
目的:探究GAD67-GFP基因敲入小鼠嗅球各细胞层中GAD67阳性神经元的分布及与一氧化氮合酶(bNOS)的共存.方法:对该实验室繁育的成年GAD67-GFP基因敲入小鼠利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因型等鉴定,取阳性GAD67-GFP基因敲入小鼠嗅球做冰冻切片进行尼氏染色、免疫荧光染色,观察GAD67阳性神经元在嗅球各细胞层中的分布比例及与bNOS共存.结果:GAD67阳性神经元在嗅小球层、僧帽细胞层、颗粒细胞层所占比例分别为:(42.98±0.92)％、(23.64 ±0.84)％、(77.75 ±0.84)％,bNOS阳性神经元在球旁细胞层、僧帽细胞层有强阳性分布,而在颗粒细胞层几乎没有分布.GAD67与bNOS仅在嗅小球层偶有共存.结论:GAD67阳性神经元主要分布于嗅小球层与颗粒细胞层,GAD67与bNOS仅少数共存于嗅小球层.
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fmr1基因敲除小鼠中间神经元发育研究的新方法
目的:通过杂交技术获得能表达GAD67 -GFP的fmr1基因敲除小鼠模型.方法:fmr1基因敲除(fmr1-ko)雌性小鼠(X-X-)和GAD67-GFP敲入基因杂合雄性小鼠(2+2-)杂交.鼠尾巴提取基因组DNA,用PCR方法鉴定所有子代基因型.对杂交后代小鼠进行行为学观察,并行脑组织切片观察绿色荧光蛋白在γ-氨基丁酸能神经元的表达.结果:PCR方法证实通过杂交繁殖出四种基因型小鼠:同时带有杂合fmr1 ko及GAD67-GFP位点的雌性小鼠(X+ X-/2 +2-)、带有纯合fmr1-ko及GAD67-GFP位点的雄性小鼠(X-Y/2 +2-)、不带有GAD67-GFP的雌性和雄性小鼠(X+X-/2-2-,X-Y/2-2-).观察发现X-Y/2+2-小鼠具有fmr1 -ko小鼠类似的行为学表现,同时在显微镜下观察到X-Y/2+2-小鼠脑组织切片有发绿色荧光的GABA神经元.结论:该杂交小鼠成功表达了GAD67-GFP,为研究γ-氨基丁酸能神经元在脆性X综合征发病机制中的作用提供一种可靠的模型.
关键词： γ-氨基丁酸能神经元 脆性X基因 基因敲除小鼠 GAD67-GFP -
GAD67-GFP精神分裂症小鼠行为学改变及海马齿状回颗粒细胞层GABA能神经元的表达
目的:探讨谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白(GAD67-GFP)基因敲入小鼠制备精神分裂症模型后学习与记忆功能的改变及海马齿状回颗粒细胞层GABA能神经元的表达.方法:利用聚合酶链式反应(PCR)鉴定GAD67-GFP基因敲入小鼠,MK-801连续腹腔注射2周制备精神分裂症动物模型,通过悬尾实验、Morris水迷宫实验、免疫荧光标记技术等,观察GAD67-GFP基因敲入小鼠的学习与记忆功能的改变及GABA能神经元在海马齿状回颗粒细胞层的表达.结果:停药后实验组与对照组比较:(1)实验组体重增加明显低于对照组(P＜0.05);(2)行为学改变:①悬尾实验:实验组不动时间明显小于对照组(P＜0.05);②Morris水迷宫实验:定位航行实验中实验组逃避潜伏期,游泳总路程明显长于对照组(P＜0.05),而其平均游泳速度与对照组没有明显差异(P＞0.05);空间探查实验中实验组经过平台所在点的次数和在平台所在象限的时间明显小于对照组(P＜0.05);(3)在海马齿状回颗粒细胞层中实验组的GFP阳性细胞明显多于对照组(P＜0.05).结论:通过对GAD67-GFP基因敲入小鼠进行腹腔注射MK-801制备精神分裂症模型后,其学习与记忆功能显著下降,且海马齿状回颗粒细胞层GABA能神经元明显增加.提示精神分裂症后学习记忆功能减退可能与GABA能神经元的表达有关.
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异丙酚诱导GAD67-GFP基因敲入小鼠意识消失过程中GABA能神经元的活化
探讨在系统性给予谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白(GAD67-GFP)基因敲入小鼠异丙酚后诱导的意识消失作用中的GA-BA能神经元的活化情况.GAD67-GFP阳性小鼠20只,腹腔注射异丙酚130 mg/kg(对照组腹腔注射相同体积的生理盐水).分别在注射后5 min,30 min,1 h进行行为学评分,随后立即处死并取脑,应用免疫组织化学观察神经元活化标记物Fos在全脑的表达分布并用免疫荧光双标的方法观察Fos与GABA能神经元的共存情况.行为学结果表明在给予异丙酚后5 min和30 min均能达到适度或深度麻醉效果,而1h时则处于过渡状态,行为学评分为5 min时13分,30 min时14分,1 h时为9分.与对照组相比,Fos在海马CAI区、杏仁核、丘脑室旁核、下丘脑室旁核、梨状核、下丘脑腹内侧核、中脑导水管周围灰质的表达在三个时间点都有明显增加(P＜0.05),在嗅球外丛状层有表达但与对照组相比无明显差异(P＞0.05).注射后5 min、30 min和1 h下丘脑腹内侧核有Fos与GABA共存,有共存的细胞占该区域Fos阳性神经元的80.3%、89.7%和91.6%.下丘脑腹内侧核GABA能神经元活化是异丙酚诱导意识消失的可能机制之一.
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刺激延髓背角诱发的小鼠脑干网状结构内向Vmo投射的GABA能神经元突触后反应的电生理学研究
本实验利用谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白(GAD67-GFP)基因敲人小鼠制备离体脑片,结合TMR逆行束路追踪技术,在荧光镜和红外镜头下,利用膜片钳伞细胞记录的方法对电刺激延髓背角(即三叉神经脊束核尾侧亚核,Vc)诱发的小鼠小细胞网状结构(PCRt)内GABA能和TMR逆标的运动的神经元的突触后反应及其反应类型、药理学特征进行系统的研究.结果显示:(1)高频刺激(20 Hz)Vc,在PCRt内GFP和TMR双标的运动前神经元上可记录纠兴奋性的突触后电流(EPSCs),波形显示为单突触反应;(2)电压钳记录模式下,α-氨基羟甲基恶唑丙酸受体(AMPA受体)拮抗剂氨基-2-硝基喹啉-2,3-二酮(CNQX)及N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA受体)阻断剂D,L-2-氨基-5-磷酸基戊酸(AP-5)均可显著降低刺激Vc所诱发的小鼠PCRt内GFP和TMR双标神经元的EPCSs的幅值;(3)电流钳模式下,刺激Vc,在PCRt内GFP和TMR舣标的神经元上记录到兴奋性突触后电位,其幅度与刺激强度在一定范嗣内呈正相关.以上结果提示,小鼠PCRt内向三叉神经运动核(Vmo)发出投射的GABA能运动前神经元可通过其细胞膜上AMPA受体或NMDA受体的介导,对口面部伤害性信息发挥整合和调控作用,以实现对口面部伤害性反射活动的精确调节.
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GAD67-GFP基因敲入小鼠5-羟色胺样和P物质样阳性终末与三叉神经中脑核神经元的联系
本研究应用免疫荧光组织化学三重标记技术,在激光共聚焦显微镜下观察了GAD67-GFP基因敲入小鼠三叉神经中脑核(Vme)内5-HT样和P物质(substance P,SP)样阳性终末分别与小白蛋白(parvalbumin,PV)样和GFP阳性神经元之间的联系.结果显示:(1)Vine内有较多的PV样阳性神经元,这些神经元绝大多数为大、中型的假单极神经元,直径约为18～40 μm;也可观察到少量的GFP阳性神经元,多为小的多极神经元,直径约为8～15 μm;(2)5-HT样阳性终末广泛分布于Vme内,其中有部分阳性终末分别聚集在PV样或GFP阳性的Vme神经元的胞体周围,计数结果表明:大约有77.7%和22.3%的5-HT样阳性终末分别与PV样或GFP阳性胞体相接触;(3)SP样阳性终未也广泛分布于Vme内,并分别与PV样或GFP阳性神经元的胞体形成密切接触,其巾有78.2%和21.8%的阳性终末分别与PV样或GFP阳性胞体相接触.以上结果提示,在口面部本体感觉信息向更高一级中枢传递过程中,5-HT能和SP能神经终末小仅对初级传入发挥直接的调控作用,还可能通过影响Vme内的GABA能神经元的活动,从而间接对该信息的传递发挥调控作用.
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GAD67-GFP基因敲入小鼠三叉上核内向三叉神经运动核投射的GFP阳性神经元表达c-fos的研究
本文综合应用逆行束路追踪(将四甲基罗达明-TMR注入一侧三叉神经运动核)和免疫荧光组织化学三重标记技术,在激光共聚焦显微镜下对谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白(GAD67-GFP)基因敲入小鼠在口周部给予伤害性刺激时,三叉上核(Vsup)内向对侧三叉神经运动核(Vmo)投射的呈GFP阳性的GABA能神经元表达c-fos的情况进行了研究.结果显示:(1)Vsup内可观察到许多GFP阳性神经元,细胞较小;(2)也可观察到许多TMR或c-fos单标神经元较密集地分布于Vsup内,其中c-fos阳性产物只见于神经元的胞核,在胞浆内未见表达;(3)在激光共聚焦显微镜下可进一步观察到部分神经元同时呈GFP/TMR、TMR/c-fos、GFP/c-fos双重标记或GFP/TMR/c-fos三重标记.其中GFP/TMR双标神经元分别占GFP或TMR阳性神经元的17.8%和19.2%;TMR/c-fos双标神经元分别占TMR或c-fos阳性神经元的34.9%和31.3%;GFP/c-fos双标神经元分别占GFP或c-fos阳性神经元的21.2%和20.5%;而GFP/TMR/c-fos 三标神经元分别占GFP、TMR或c-fos阳性神经元的11.1%、12%和10.8%.以上结果表明小鼠Vsup内部分GABA能神经元可接受来自同侧的口面部伤害性信息,并对这些信息进行整合后,直接发出投射纤维至Vmo;故Vsup内部分GABA能运动前神经元可能参与口面部伤害性反射局部环路的构成.
