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人源性抗乳腺癌HER2噬菌体单链抗体库的构建与筛选
目的:构建人源性抗乳腺癌噬菌体单链抗体(scFv)库,筛选和鉴定抗乳腺癌人类表皮生长因子受体2(HER2)特异性scFv,为HER2和CXC趋化因子受体4 (CXCR4)双靶向融合蛋白的研制提供靶向HER2的高亲和力序列.方法:取已确诊的乳腺癌患者癌旁淋巴组织,提取总RNA;构建可变区基因的T载体库,将重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因与pCANTAB连接肽连接,获得pCANTAB-scFv,电转化感受态大肠杆菌TG1;以M13K07辅助噬菌体进行感染,获噬菌体抗体库;利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测筛选后获得的噬菌体抗体活性,以免疫组织化学法检测抗体亲和力,并通过测序进一步鉴定.结果:成功构建大容量pCANTAB-scFv抗体库,获得的scFv长度为750 bp,VH和VL长度分别为375和330 kb;电转化大肠杆菌TG1后酶切验证插入片段大小正确,得到库容为2.48×108的大容量抗体库;通过噬菌体展示和淘洗筛选,富集针对乳腺癌细胞株SKBR-3表面抗原的抗体库;所得抗体对HER2有高度的亲和力和特异性,对乳腺癌组织HER2抗原也具有较高的亲和力;测序结果与人IgG抗体进行对比,所获得的scFv具有高度的人源性.结论:主要构建了大容量人源性抗乳腺癌细胞的噬菌体scFv库,并筛选获得可特异性识别人乳腺癌HER2的高亲和力scFv,为制备以HER2为靶点的抗肿瘤HER2和CXCR4双靶向融合蛋白提供了载体.
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用兔IgG筛选噬菌体展示免疫球蛋白结合分子组合文库
目的 应用噬菌体展示免疫球蛋白(Ig)结合分子组合文库,进化筛选获得与兔IgG结合的代表性序列,测定其与兔IgG及人IgG结合活性的差异,以判断筛选获得的代表性序列对不同种属Ig的结合是否存在倾向性的差别.方法 应用包含Ig效应子结合蛋白Protein A的D结构域(PA-D)、A结构域(PA-A),Protein G的B2结构域(PG-B2)及protein L的B3结构域(PL-B3)的单结构域随机组合文库,以兔IgG对该组合文库进行进化筛选,序列比较分析筛选获得的代表性序列与人IgG进化筛选文库所得代表性序列的异同性;用ELISA和竞争抑制试验分别测定阳性噬菌体克隆与兔IgG及人IgG的结合活性.结果 以兔IgG经4轮分子进化筛选,获得在天然细菌蛋白中不存在的新的结构形式PA-A-PA-A,该结果与人IgG进化筛选所得代表性序列PA-A-PG有显著差异;兔IgG筛选序列PA-A-PA-A和人IgG筛选序列PA-A-PG分别显示出与兔Ig和人Ig结合力更强的特性.结论 该研究首次应用噬菌体展示技术研究不同种属抗体效应子构象的不同,证实兔IgG和人IgG两者效应子构象之间确实存在差异.这一结论有助于阐明抗体效应子构象在不同种属之间的差异性.
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噬菌体展示免疫球蛋白结合分子定点随机突变组合文库的构建
目的 构建噬菌体展示免疫球蛋白结合分子定点随机突变组合文库,为应用各种类型免疫球蛋白对该文库进行体外分子进化筛选及结构和功能的研究打下基础.方法 应用overlapping PCR制备Protein A的Z结构域.用含随机核苷酸序列的引物,制备对Z结构域的第10、13、27、28、31和32位氨基酸进行随机突变的定点随机突变体库.并在突变体片段两端引入Kpn Ⅰ位点,3'端引入3个氨基酸大小随机连接肽的序列.经Kpn Ⅰ酶切后随机连接,克隆于噬菌粒展示载体pCANTAB5S.克隆产物转化大肠杆菌TG1,辅助噬菌体M13K07拯救,构建噬菌体展示定点随机突变组合文库.结果 该定点随机突变组合文库的转化子数目为6.4×106个,滴度为1.4×1015 TU/L;文库中含0.72以上的阳性克隆,其中有2个单结构域的阳性克隆占0.15;15个样品的序列分析显示各突变位点和随机连接肽的氨基酸序列呈随机性分布.结论 成功构建了噬菌体展示免疫球蛋白结合分子定点随机突变组合文库,该库库容量在一级结构上具有良好的随机性和多样性,可满足体外分子进化研究的要求.
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噬菌体展示IgA亲和体随机组合文库的构建
目的 构建噬菌体展示IgA亲和体随机组合文库,研究IgA结合分子结构与功能的关系.方法 基因合成IgA亲和体ZA1、ZA2片段.片段两端引入Kpn I酶切位点,3'端引入随机连接肽序列,Kpn I酶切,随机连接,克隆于噬菌粒展示载体pCANTAB5S的Kpn I克隆位点上,转化大肠杆菌TGI,辅助噬菌体M13K07拯救,构建噬菌体展示随机组合文库.结果 基因合成IgA亲和体;构建噬菌体展示IgA亲和体随机组合文库,容量为3.4×107,滴度为1.6×1012 TU/L;文库中含79%以上的阳性克隆;序列分析显示组合文库由ZA1、ZA2随机组合而成,连接方式符合随机连接的特点,各亲和体之间连接肽序列也呈随机分布.结论 合成IgA亲和体,构建噬菌体展示IgA亲和体随机组合文库,该文库库容量、多样性和随机性可满足体外分子进化研究的要求.
关键词： 细菌噬菌体/遗传学
