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日本血吸虫(中国大陆株)20.2 kDa分子编码基因(Sj20.2)的克隆及序列分析
目的克隆日本血吸虫中国大陆株20.2 kDa分子的编码基因.方法根据筛选到的日本血吸虫肝期童虫cDNA文库阳性克隆之一的插入片段序列,设计合成1对引物,通过PCR技术对其大开放阅读框进行扩增,然后克隆入pGEM-T载体,并对克隆产物进行核苷酸序列测定和分析,利用在线软件推测其编码氨基酸的序列.结果利用PCR方法从上述插入片段中扩增出1条单一的DNA条带,大小介于51 5 bp与697 bp之间.将此产物克隆入pGEM-T载体,双酶切和PCR反应结果都出现与前述结果一致的目的片段;核苷酸序列测定结果表明此开放阅读框全长564 bp,在线软件分析结果表明,此片段编码187个氨基酸,编码肽段分子量大小约为20.2 kDa.结论本次实验成功扩增和克隆出目的基因片段,为下一步研究奠定了基础.
关键词： 日本血吸虫(中国大陆株) 20.2 kDa分子 基因克隆 -
日本血吸虫表达序列标签和新基因的获取和分析
目的分离、鉴定和分析日本血吸虫表达基因序列,为日本血吸虫病提供侯选疫苗分子和药物靶点.方法筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,对重组阳性克隆进行测序以获取的EST;对可能成为新基金的克隆进行步移法测序获取全长cDNA,并进行生物信息学分析.结果共获得149个EST,分析发现某些EST与血吸虫的生活史的不同阶段和不同性别序列有一定的同源性.共获取18个日本血吸虫新基因,大部分为管家基因,其中部分基因可作为日本血吸虫的侯选疫苗分析和药物靶点.结论EST技术可用于快速、经济地发现日本血吸虫成虫新基因.
关键词： 日本血吸虫(中国大陆株) cDNA文库 表达序列标签 基因 -
SjESG-2A锤头状核酶表达载体构建及其抗日本血吸虫虫卵发育研究
目的 设计并合成日本血吸虫中国大陆株卵壳蛋白基因2A(eggshell protein gene 2A,ESG-2A)的特异性锤头状核酶并构建真核表达载体.探讨其在BALB/c小鼠体内的抗日本血吸虫虫卵发育作用.方法 运用计算机软件人工设计并合成核酶基因(RZ) , 将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1 ( + ) 中, 采用双酶切、琼脂糖凝胶电泳及DNA序列测定方法鉴定阳性克隆.以日本血吸虫尾蚴感染BALB/c小鼠,建立动物模型.大量抽提阳性重组子,分别在小鼠感染时、感染后2w、感染后4w,将其经后腿胫前肌免疫BALB/c小鼠,共3次.小鼠感染6w后计数成虫负荷及肝组织虫卵数.ELISA法检测小鼠脾淋巴细胞培养上清IFN-γ和IL-4的水平.结果 经酶切电泳及DNA 测序证实合成的核酶基因序列正确并已被准确克隆入pcDNA3.1 ( + ) 的Xba I 和EcoR I 酶切位点之间, 命名为pcRz-ESG-2A.在核酶组,IFN-γ的水平呈上升趋势,IL-4的水平呈先上升后下降;在空载体组和生理盐水组,IFN-γ的水平呈上升趋势,IL-4的水平也呈上升趋势.核酶组免疫BALB/c小鼠能诱生减虫率25.64%和减卵率44.21%.结论 成功合成SjESG-2A特异性的锤头状核酶基因并构建了该基因的真核表达载体.核酶在已感染日本血吸虫尾蚴的BALB/c小鼠体内具有抗日本血吸虫虫卵发育的作用.
关键词： 日本血吸虫(中国大陆株) 卵壳蛋白基因2A 锤头状核酶 虫卵发育 -
日本血吸虫(中国大陆株)若干酶类基因的发现
目的运用表达序列标签(EST)技术,从日本血吸虫(Schistosomajaponicum,Sj)cDNA文库中分离、鉴定出有潜在应用价值的血吸虫基因序列.方法应用EST方法,从日本血吸虫cDNA文库中随机挑选出单个重组克隆,PCR扩增出插入片段,并进行PCR产物直接测序;将获得的序列资料与EBI和GenBank进行BLASTn和BLASTx同源性检索,对可能的酶类基因序列进行分析.结论采用EST策略,可获得日本血吸虫(中国大陆株)若干酶类基因序列EST,为进一步的cDNA全长扩增和克隆奠定基础.
关键词： 日本血吸虫(中国大陆株) cDNA文库 表达序列标签(EST) 酶 糖酵解酶 -
日本血吸虫(中国大陆株)表达基因的分离和EST序列测定
目的运用表达序列标签技术(EST方法)，从Sj cDNA文库中分离、鉴定和测定血吸虫表达基因序列。方法应用EST方法，从Sj cDNA文库中随机挑选出单个重组克隆进行PCR直接序列分析，通过互联网将获得的EST序列送入NCBI GenBank进行同源性检索，并将发现的未知基因EST序列送入NCBI dbEST以获得GenBank进入号。结果分离了100个Sj重组克隆，并已对25个克隆cDNA插入片段的PCR产物进行直接序列分析，获得了21个EST序列。其中2个EST序列为GenBank中已知的血吸虫基因序列，19个为未知基因序列。这19个EST序列已被NCBI dbEST和GenBank接受并获得了新序列进入号。结论采用EST-PCR直接序列分析方法可大量获得血吸虫表达基因EST序列，为进一步开展日本血吸虫(中国大陆株)表达基因的研究奠定了基础。
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日本血吸虫(中国大陆株)成虫表达序列标签的获取及新基因的发现
目的运用表达序列标签(Expressed Sequence Tag,EST)技术快速、经济地发现日本血吸虫(中国大陆株)新基因.方法随机挑取日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA文库单个重组克隆进行部分测序以获得EST,获得的EST通过BLAST程序同EMBL寄生虫数据库和GenBank数据库进行比较及同源性分析.结果本研究共随机挑取日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA 文库单个重组克隆200个,获得了76个有EST价值的序列,其中7.9%为日本血吸虫已知序列,5.3%为日本血吸虫同源序列.曼氏血吸虫或其他生物的同源序列占有EST价值的序列的22.4%,未知序列占59.2% .在获得的76个有EST价值的序列中,66个成功在GenBank dbEST中登录.通过同源性分析,发现了一些令人感兴趣的基因.结论 EST方法有助于快速、经济地发现日本血吸虫(中国大陆株)成虫新基因.
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日本血吸虫表达序列标签的获取和分析
目的运用表达序列标签(expressed sequence tag, EST)技术,从日本血吸虫成虫cDNA文库中分离、鉴定和分析表达基因序列,为日本血吸虫病的防治提供候选疫苗和药物靶点.方法构建日本血吸虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,将获取的EST登录GenBank,并进行生物信息学分析.结果随机挑取382 个阳性克隆进行测序,获得149个EST(登录号分别为:CA747382～CA747391, BU917055～BU917058, CA305307～CA305309, BU581980, BU582400～BU582403, BU666906和CA946548～CA946666),同源性比较发现,部分序列与血吸虫的生活史的不同阶段和不同性别序列有一定的同源性.结论 EST技术有助于快速、经济地获取和研究日本血吸虫表达基因.
关键词： 日本血吸虫(中国大陆株) cDNA文库 表达序列标签 -
Sjcb2基因原核表达载体的构建及表达
目的 探讨日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Si)中国大陆株(Chinese strain)组织蛋白酶B肽链内切酶基因(Cathepsin B endopeptidase)的原核表达载体pWR450-1的构建及表达情况. 方法 根据Genbank中Cathepsin B endopeptidase全序列(Genbank登录号为AY226984)设计特异性引物应用聚合酶链反应技术扩增基因全长,克隆入pUCm-T载体,酶切后亚克隆入原核表达载体pWR450-1并进行表达;利用SDS-PAGE及Western blotting观察日本血吸虫组织蛋白酶B肽链内切酶表达情况.结果 成功构建了Sjcb2/pWR450-1原核表达重组质粒,该重组质粒在大肠杆菌中可经IPTG诱导表达分子量约为86kD的融合蛋白,Western blotting分析表明,该融合蛋白能被兔阳性血清所识别.结论 日本血吸虫组织蛋白酶B肽链内切酶可在原核表达载体pWR450-1中表达,为研究其功能打下了必要的基础.
关键词： 日本血吸虫(中国大陆株) 组织蛋白酶B肽链内切酶 原核表达 -
Sjcb2 DNA疫苗的构建及其在真核细胞中的表达
目的克隆日本血吸虫组织蛋白酶B基因,构建真核表达重组质粒,转染真核细胞,观察其表达情况.方法用PCR技术从已构建好的重组质粒pBC SK+/Sjcb2中扩增出Sjcb2基因片段,重组入克隆载体pUCm-T.再将Sjcb2基因片段亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+).进行PCR、双酶切和DNA序列鉴定后,运用电穿孔技术将重组体pcDNA3.1(+)/Sjcb2转染HeLa细胞,间接免疫荧光技术观察目的基因的表达. 结果成功扩增出Sjcb2基因片段并构建DNA疫苗;重组质粒在HeLa细胞中获得表达.结论Sjcb2基因能够在体外真核细胞中表达.
关键词： 日本血吸虫(中国大陆株) 组织蛋白酶B DNA疫苗 真核表达 -
日本血吸虫ATP合酶脂结合蛋白样基因DNA疫苗的构建及其在真核细胞中的表达
[目的]构建日本血吸虫ATP合酶脂结合蛋白样基因(ATP synthase lipid-binding protein-like protein gene of Schistosoma japonicum, SjAslp)核酸疫苗,并观察其在真核细胞中的表达情况.[方法]根据GenBank中SjAslp cDNA全长设计特异性引物,从实验室已构建好的重组质粒pBCSK+/SjAslp中扩增出SjAslp cDNA全长,将其克隆入pUCm-T.载体,再亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)构建成日本血吸虫组织蛋白酶B肽链内切酶全基因核酸疫苗(pcDNA3.1(+)/SjAslp);经PCR、酶切及测序鉴定后,利用电穿孔将其转染HeLa细胞.采用免疫细胞化学法检测SjAslp在HeLa细胞内的表达情况.[结果]成功构建SjAslp核酸疫苗,免疫细胞化学技术检测其能在HeLa细胞浆内表达.[结论]pcDNA3.1(+)/SjAslp核酸疫苗能在真核细胞内表达,为抗日本血吸虫核酸疫苗的研制打下了必要的基础.
