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HCCR-2干扰真核表达载体的构建及其稳定转染细胞系的建立
目的 构建HCCR-2于扰真核表达载体,获得干扰质粒稳定转染的HepG2细胞系.方法 人工合成HCCR-2基因干扰序列并定向插入到RNAi真核表达载体PGenesil-l,通过测序鉴定.将干扰质粒用脂质体法转染HeoG2细胞,经G418持续压力选择和有限稀释法获得稳定转染的细胞系.RT-PCR检测筛选克隆HCCR-2 mRNA的表达水平.结果 测序表明HCCR-2干扰序列及读框完全正确,干扰质粒稳定转染的HepG2细胞系在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光.RT-PCR结果显示RNAi-H1、RNAi-H3序列对HCCR-2 mRNA有较好的抑制效果.结论 成功构建了HCCR-2干扰真核表达载体,HCCR-2干扰质粒稳定转染的HepG2细胞系的建立为进一步研究HCCR-2在肝癌细胞中的作用奠定了基础.
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人子宫颈癌基因HCCR-2反义真核表达载体的构建及鉴定
目的 克隆人子宫癌基因HCCR-2并构建其反义真核表达载体.方法 从人肝癌细胞株HepG2提取RNA,利用RT-PCR方法,克隆出一包括HCCR-2编码区的长约1 kb的片段,并将其与T载体连接,测序证实无误后,用Sa1 Ⅰ、Sac Ⅱ双酶切重组T载体,然后将该片段反向插入真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点,后对重组真核表达载体进行双酶切鉴定.结果 RT-PCR扩增出一长约1 kb的HCCR-2片段,琼脂糖凝胶电泳显示目的片段成功反向连接到plRES2-EGFP载体上.结论 成功克隆了HCCR-2基因并构建了其反义真核表达载体pIRES2-EGFP/HCCR-2(-).
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HCCR-2反义核酸对肝癌HepG2细胞的作用
目的 研究反义HCCR-2真核表达载体对肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响.方法 构建反义HCCR-2真核表达载体(反义载体组),转染肝癌HepG2细胞,G418筛选阳性克隆,同样方法获得空载体pIRES2-EGFP稳定表达的细胞株(空载体组),取肝癌HepG2细胞为对照(肝癌HepG2组),用MTT法、流式细胞仪、透射电镜观察反义HCCR-2转染前后肝癌HepG2细胞生长曲线、细胞周期、细胞凋亡及细胞形态的变化.采用单因素方差分析和χ2检验比较各组差异.结果 反义载体组、空载体组、肝癌HepG2组HCCR-2 mRNA表达水平分别为0.39±0.04、0.62±0.06、0.72±0.03,3组比较差异有统计学意义(F=43.701,P<0.05);细胞凋亡率分别为13.30%、2.51%、2.07%,反义载体组与空载体组、肝癌HepG2组比较,差异有统计学意义(χ2=6.793,8.721,P<0.05);反义载体组细胞生长减慢,阻滞于G0/G1期.结论 HCCR-2反义核酸真核表达载体能抑制HCCR-2 mRNA的表达,促进细胞凋亡,HCCR-2蛋白可能参与肝癌细胞的周期调控,并与细胞的生长增殖有关.
