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大鼠肾小球分离和离体培养方法的建立
本文旨在建立大鼠肾小球分离和离体培养的实验方法.应用差异过筛法分离技术分离大鼠肾小球,用Ⅳ型胶原酶消化法去除Bowman囊,用相差显微镜观察肾小球纯度和形态结构,台盼蓝拒染法检测肾小球的活性,双标免疫荧光技术鉴定肾小球固有细胞的标志蛋白nephrin和α-SMA的表达分布,荧光显微镜和酶标仪检测Ang Ⅱ对离体培养肾小球ROS水平的影响,real-time PCR方法观察离体培养的肾小球中TGF-β1 mRNA和collagen Ⅳ mRNA的水平.结果显示,离体培养的肾小球结构完整,无包囊,毛细血管袢结构清晰;离体培养48 h后,肾小球内细胞仍具有活性;激光共聚焦显微镜下可见肾小球内足细胞和间质细胞的标志蛋白nephrin和α-SMA表达清晰;给予离体培养的肾小球Ang Ⅱ刺激后,肾小球ROS的产生明显增加,TGF-β1和collagen Ⅳ mRNA水平升高.以上结果提示,大鼠肾小球的分离及离体培养技术建立成功,该分离方法获得的肾小球可以进行离体培养及药物作用观察,为基础和临床研究提供实验技术和研究手段.
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肾小球分离与纯化在肾脏病学中的应用
目的:发明一种快速易行的肾小球分离技术,为肾脏病学研究服务.方法:小鼠麻醉后,经体循环灌注四氧化三铁溶液,使肾小球内的毛细血管中充满四氧化二铁溶液.然后取出肾脏切碎,用collagenase A消化,细胞器滤过,磁铁吸附并收集含铁的肾小球.光镜、透射和扫描电镜观察肾小球的正常形态和结构.常规方法提取RNA和蛋白质,并进行qRT-PCR,micro RNA(miRNA)基因芯片和Western blot等定量检测.结果:该方法可从新生小鼠和成体小鼠的肾脏中高质量快速提纯不同发育阶段(发育早期、中期或晚期)及成熟的肾小球,分离后的肾小球光镜形态结构以及超微结构均保存完好.常规方法提取的RNA和蛋白质可用于qRT-PCR,Western blot检测以及miRNA基因芯片等分子生物学的定性和定量分析研究.结论:该研究所述的肾小球分离技术费用低廉,简便易行,为基础与临床探索肾小球对各种肾脏疾病的基因调控作用和发育分子生物学研究提供了重要的方法和技术手段.
