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旋毛虫成囊前期幼虫抗原结构基因TspE1的克隆与表达
目的克隆和表达旋毛虫河南地理株成囊前期幼虫编码31 kDa抗原的结构基因(TspE1).方法大鼠感染旋毛虫后第17天收集成囊前期幼虫,提取虫体的总RNA.通过RT-PCR特异性扩增目的基因,构建重组质粒pUC18/Ts-HN3,将重组质粒pUC18/Ts-HN3中的目的基因亚克隆入原核表达载体pGEMEX-1,构建重组子pGEMEX-1/Ts-HN3,经IPTG诱导,在E..coli JM109(DE3)中表达.对表达产物进行SDS-PAGE分析和Westem blotting鉴定.结果SDS-PAGE显示目的基因在大肠杆菌中获得高效表达,重组蛋白的分子量为31 kDa,以诱导4 h时表达量多.薄层凝胶光密度扫描分析结果显示,表达的融合蛋白量约占细菌总蛋白的26%.Westem blotting证实,融合蛋白条带能被感染旋毛虫的大鼠血清及旋毛虫病患者血清识别.结论旋毛虫河南地理株成囊前期幼虫抗原结构基因TspE1克隆和原核表达成功.
关键词： 旋毛虫(河南地理株) 成囊前期幼虫 31kDa抗原 分子克隆 表达 -
旋毛虫DNA疫苗诱导小鼠免疫应答的研究
目的观察旋毛虫DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答.方法将旋毛虫肌幼虫编码31kDa抗原结构基因真核表达质粒pcDNA3-TspE1分别用肌肉注射和基因枪免疫BALB/c小鼠,免疫血清用旋毛虫肌幼虫冰冻切片及石蜡切片抗原进行IFAT检测,并用旋毛虫肌幼虫可溶性抗原进行Western blot分析.结果 IFAT表明pcDNA3-TspE1接种BALB/c小鼠后产生的免疫血清与旋毛虫肌幼虫可产生阳性反应,在肌幼虫冰冻及石蜡切片上均显示黄绿色荧光.Western blot检测结果显示,pcDNA3-TspE1接种小鼠后产生的免疫血清只能识别旋毛虫肌幼虫可溶性抗原中的31kDa抗原组分,而pcDNA3质粒接种小鼠后的血清不能与旋毛虫肌幼虫可溶性抗原发生免疫反应.结论旋毛虫DNA疫苗pcDNA3-TspE1能够诱导小鼠产生特异性体液免疫应答.
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旋毛虫成囊前期幼虫编码31 kDa抗原基因的分子克隆及序列分析
目的克隆旋毛虫河南株成囊前期幼虫编码31kDa抗原基因(TspE1)片段,并测定其基因序列,以了解该基因序列与已报道虫株的差异.方法根据TspE1基因已知序列设计合成一对引物,采用RT-PCR技术获取旋毛虫成囊前期幼虫目的基因,PCR产物经纯化后用BamHⅠ、HindⅢ进行双酶切,定向克隆入pC18质粒,转化大肠杆菌JM109;重组质粒用BamHⅠ+HindⅢ酶切及PCR扩增鉴定.用Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定,应用DNASIS软件进行同源性比较及预测抗原表位.结果 RT-PCR扩增获得成囊前期幼虫TspE1基因(约870bp),EcoRⅠ酶切鉴定正确;筛选出7个阳性克隆,对目的基因的测序结果显示有5种类型,但都与GenBank中的TspE1基因序列及由其推测的氨基酸序列有较高同源性,尤其是Ts-HN3核苷酸及氨基酸序列同源性分别达99.6%和98.9%;TspE1基因中可能存在7个抗原表位.结论应用RT-PCR技术扩增出旋毛虫河南株成囊前期幼虫编码31kDa抗原结构基因,证实TspE1基因在成囊前期幼虫已有表达;结果还提示在旋毛虫河南株之间可能存在有遗传多态性.
