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定点突变技术鉴定弓形虫微线体蛋白6与醛缩酶的作用位点
目的 利用定点突变技术鉴定弓形虫微线体蛋白6 (MIC6)与醛缩酶的作用位点. 方法 根据GenBank中的弓形虫RH株MIC6基因序列(登录号为AF110270)及C端序列设计特异性引物,将MIC6蛋白羧基端(MIC6C) 348位色氨酸(W348)的密码子碱基突变为缬氨酸(Ⅴ)的碱基,PCR扩增MIC6C W/V突变体基因片段,克隆至原核表达质粒pGEX-4T-1,转化至大肠埃希菌BL21 (DE3);0.8 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST-MIC6C W/V突变体蛋白,亲和层析法纯化表达产物.以GST-MIC6C W/V突变体蛋白为探针蛋白,GST-MIC6C蛋白为对照蛋白,分别与弓形虫速殖子裂解液进行GST沉降实验,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析实验产物.分别以GST-MIC6C W/V突变体蛋白和GST-MIC6C蛋白为探针蛋白和对照蛋白,与弓形虫醛缩酶蛋白液进行GST沉降实验,SDS-PAGE分析实验产物. 结果 获得了MIC6CW/V突变体基因片段,构建了相应的原核表达载体,表达并纯化了GST-MIC6C W/V突变体蛋白.GST-MIC6C W/V突变体蛋白与弓形虫速殖子裂解液的GST沉降产物中未见蛋白条带,而GST-MIC6C蛋白的沉降产物中可见一蛋白条带,且能被抗醛缩酶抗体特异识别;GST-MIC6C W/V突变体蛋白与弓形虫醛缩酶蛋白液的GST沉降产物中未见蛋白条带,而GST-MIC6C蛋白的沉降产物中可见一蛋白条带. 结论 色氨酸(W348)为MIC6与醛缩酶的作用位点.
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弓形虫MIC 6羧基端蛋白片段的表达及其多克隆抗体的制备
目的 克隆表达刚地弓形虫微线体蛋白6羧基端蛋白片段(TgMIC6C),制备多克隆抗体.方法 PCR扩增目的 基因片段,克隆到pGEX-4T-1载体上,构建MIC6C/pGEX-4T-1原核表达系统;IPTG诱导表达GST-MIC6C融合蛋白,亲和层析融合蛋白;用纯化的融合蛋白混合免疫佐剂免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,纯化并分析抗体的特异性.结果 构建了MIC6C/pGEX-4T-1原核表达系统并获得纯化的GST-MIC6C融合蛋白;获得了抗目的 蛋白的多克隆抗体,抗体能特异地识别目的 蛋白,抗体效价为1∶8 000.结论 在体外获得了纯化的GST-MIC6C融合蛋白及其多克隆抗体,为后续GST pull-down筛选与MIC6相互作用的蛋白奠定了基础.
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刚地弓形虫微线体蛋白6和醛缩酶在虫体内的定位
目的 观察刚地弓形虫微线体蛋白6(MIC6)和醛缩酶在虫体内的定位.方法 聚合酶链反应扩增微线体蛋白2羧基端(MIC2C)基因片段,构建MIC2C/pGEX-4T-1/BL21表达系统,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达谷胱苷肽巯基转移酶-MIC2C (GST-MIC2C)蛋白,用该蛋白免疫新西兰兔,制备GST-MIC2C多克隆抗体.刚地弓形虫速殖子涂片,分别用一抗、荧光二抗温育,荧光显微镜下观察.结果 成功获得GST-MIC2C多克隆抗体.荧光显微镜下显示MIC6(红色荧光)和醛缩酶(绿色荧光)2种蛋白皆定位于弓形虫的顶端.结论 刚地弓形虫MIC6与醛缩酶在虫体内存在共定位关系,为2种蛋白相互作用关系的确立提供了细胞定位学证据.
