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杜氏利什曼原虫表达位点相关基因样蛋白的分子克隆及表达定位
目的 克隆杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)无鞭毛体特异表达新基因,观察其编码蛋白的亚细胞定位.方法 制备杜氏利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体mRNA,以消减抑制杂交技术筛选无鞭毛体新的表达序列标签,扩增含有新表达序列标签的基因全长cDNA,Northen杂交和RT-PCR检测新基因在前鞭毛体和无鞭毛体中的表达,共表达方法观察杜氏利什曼原虫内新基因编码蛋白的亚细胞定位.结果构建了杜氏利什曼原虫无鞭毛体表达序列标签消减文库,克隆到一个新基因,命名为表达位点相关基因样蛋白(ESAGLP)基因,其cDNA全长为2 258 bp,编码620 aa.ESAGLP基因仅在无鞭毛体内表达,其编码蛋白定位于线粒体.结论 ESAGLP鉴定为杜氏利什曼原虫无鞭毛体新基因,其编码蛋白定位于无鞭毛体的线粒体.
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利用消减抑制杂交技术构建MPTP诱导的C57BL小鼠全脑差异表达基因文库
本研究旨在构建1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的C57BL小鼠全脑差异表达基因文库,并获取差异表达的表达序列标签.通过MPTP腹腔注射建立C57BL小鼠帕金森病模型.利用消减抑制杂交技术建立对照组与实验组差异表达基因文库.自两文库中各随机挑选20个克隆,经反Northern杂交证实其中7个克隆为阳性.同时对上述40个克隆进行序列测定,并与已知序列基因库进行同源性比较,其中26个新基因片段向Genbank申请了序列号.
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食管癌消减cDNA文库的构建
目的:采用消减抑制杂交技术,研究正常食管粘膜和食管癌组织之间的基因表达差异状况,分离食管癌相关基因片段,构建食管癌的消减cDNA文库.方法:以食管癌癌组织为测试子(tester),以正常食管粘膜组织为驱赶子(driver),用消减抑制杂交方法分离食管癌差异表达片段.将该差异表达片段克隆至T载体,经蓝白斑筛选后, 再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建食管癌消减cDNA文库.结果:用消减抑制杂交技术分离食管癌差异表达片段,经蓝白斑筛选,得到220个白色克隆;再用PCR方法快速筛选出100个两端分别含连接子Adaptorl 及Adaptor2R的阳性重组质粒100个,从而成功地构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库.结论:构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库.消减抑制杂交技术能快速有效地分离差异表达基因,方法简便、灵敏度高.使用PCR法快速筛选阳性克隆,对于消减文库的构建具有重要意义.
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食管癌相关基因片段的筛选与鉴定
目的:从已构建的中国人食管癌特异的消减cDNA文库中,初步筛选与鉴定食管癌相关基因片段.方法:随机挑选48个片段作反Northern印迹杂交分析,将杂交信号有差别的15个片段送测序公司进行测序,用Gen Bank Blast程序检索,以同源性很小的cDNA片段作为新基因的候选基因,观察其在食管癌组织和正常食管粘膜组织中的表达情况.结果:所获得的7个序列中:3y59与已知基因同源性很小,且3y59在30例食管癌及其配对正常食管粘膜组织中,19例(63.3%)表达有差别,11例(36.7%)表达无差别(P＜0.05).3y88与已知基因geminin基因部分同源.另外5个片段3y20,3y14,3y90,3y91和3y92分别与核糖体蛋白RpL7a,TLH29蛋白驱动子,Hsp70/Hsp90 organizing protein,Keratin6(KRT6C)和内膜蛋白等已知基因序列高度同源.结论:3y59可能是与食管癌的发生、发展有关的新的候选基因.首次发现,geminin基因,核糖体蛋白RpL7a,TLH29蛋白驱动子,Hsp70/Hsp90-organizing protein,Keratin6(KRT6C),内膜蛋白等已知基因可能与食管癌的发生发展有关.
关键词： 食管癌 基因 消减抑制杂交 反Northern印迹杂交 反转录PCR -
消减抑制杂交及其在肿瘤研究中的应用
消减抑制杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)是近提出的一种以抑制PCR为基础的差异显示基因克隆技术.该方法具有简便易行、特异性高、能分离出丰度较低的特异性片段等优点,并已成功应用于肿瘤、发育生物学、免疫调控等方面的研究,本文简述其原理、方法、及在肿瘤研究中的应用进展,并对其方法的优缺点和应用前景进行分析.
