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鸟苷酰环化酶C与大肠癌微转移检测
鸟苷酰环化酶C是新近发现的鸟苷酰环化酶家族成员之一,仅在大肠组织中表达,在细胞发生恶变、肿瘤转移等改变时,这种表达持续存在,因此非常适合大肠癌微转移的检测.本文主要阐述了鸟苷酰环化酶C在大肠癌微转移诊断中的应用及大肠癌微转移的研究近况.
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实时荧光定量PCR检测大肠癌患者外周血鸟苷酰环化酶C基因及其临床意义
目的:建立人鸟苷酰环化酶C(GC-C)含量实时荧光定量PCR(RFQ-PCR)检测的新方法,观察大肠癌患者外周血单个核细胞(PBMC)GC-C mRNA表达水平并探讨其临床意义.方法:在GC-C基因高保守区设计了特异性的引物和探针,RT-PCR扩增目的片段并实时检测产物的荧光强度,根据标准品建立的标准曲线,由软件自动计算出待测样本(30例健康献血员、11例大肠良性病变和37 例大肠癌)中GC-C mRNA准确含量,并以GC-C mRNA和β2微球蛋白 mRNA含量的比值作为评价GC-C表达水平的指标.结果:本法检测GC-C mRNA含量的线性范围为101 ～109 pg/ml,样本批内和批间变异系数(CV)值分别为6.87%～11.12%和8.86%～15.19%.30例健康献血员和11例大肠良性病变样本的PBMC中均未检出GC-C mRNA表达,大肠癌患者外周血GC-C mRNA的检出率为83.8%(31/37).大肠癌患者外周血PBMC GC-C mRNA表达水平为0.88±0.06,与Duke分期、淋巴结转移和肝转移密切相关,与年龄、性别、肿瘤大小等无关.结论:GC-C mRNA RFQ-PCR检测外周血大肠癌细胞具有较好的检测灵敏度、特异性和重复性,GC-C mRNA表达水平可能对指导大肠癌Duke分期、判断淋巴结转移和肝转移、指导术后综合治疗均有一定价值.
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实时荧光定量PCR检测鸟苷酰环化酶C基因表达方法的建立
目的建立实时荧光定量PCR(RFQ-PCR)检测鸟苷酰环化酶C(GC-C)基因表达的方法.方法在GC-C基因高保守区设计了特异性的引物和探针,RT-PCR扩增目的片段并实时检测产物的荧光强度,根据标准品建立标准曲线,由软件自动计算出待测样本中GC-C mRNA含量,并以GC-C mRNA和β2M mRNA含量的比值作为评价GC-C表达水平的指标.结果本法检测GC-C mRNA含量的线性范围为101pg/ml～109pg/ml,样本批内和批间CV值分别为6.87%～11.12%和8.86%～15.19%.30例健康献血员和11例大肠良性病变患者的外周血单个核细胞(PBMC)中均未检出GC-C mRNA表达,大肠癌患者PBMC的GC-C mRNA检出率为83.8%(31/37),表达水平为0.88±0.06.10例大肠癌组织和T84细胞株均检出GC-CmRNA,表达水平分别为每μg组织(0.86±0.07)和每个细胞0.0082.结论成功建立RFQ-PCR检测GC-C mRNA含量的方法,具有较好的检测灵敏度、特异性和可重复性.
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鸟苷酰环化酶C小干扰RNA对胃癌细胞生长的影响
目的:研究靶向鸟苷酰环化酶C(Guanylyl cyclase C,GC-C)的小干扰RNA(siRNA)对人胃癌SGC-7901细胞体外生长能力的影响.方法:利用pSilencerTM4.1-CMV neo通过 siRNA表达载体法制备GC-C siRNA.将GC-C siRNA转染胃癌SGC-7901细胞,采用RT-PCR和间接免疫荧光观察转染前后胃癌细胞GC-C基因的表达变化,黏附实验观察转染前后胃癌细胞黏附能力.结果:构建的GC-C siRNA测序鉴定与设计完全相符.GC-C siRNA转染胃癌SGC-7901细胞后,明显抑制GC-C基因的表达.转染后,GC-C mRNA和蛋白表达分别抑制了66.7%和75.8%,细胞黏附能力较对照组减弱(P<0.05).结论:靶向GC-C的siRNA可明显下调靶基因GC-C的表达,在体外抑制胃癌SGC-7901细胞的黏附,提示GC-C基因与胃癌的发生、发展有密切的关系.
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小干扰RNA沉默鸟苷酰环化酶C基因促进胃癌细胞的凋亡
目的:利用RNA干扰技术,研究靶向鸟苷酰环化酶C(Guanylyl cyclase C ,GC-C)的小干扰RNA(siRNA)在体外对人胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响.方法:利用pSilencerTM4.1-CMV neo通过siRNA表达载体法制备GC-C siRNA,将GC-C siRNA转染胃癌SGC-7901细胞,流式细胞检测技术及原位末端标记(TUNEL)法检测转染前后细胞的凋亡.结果:流式细胞仪结果分析示转染组平均凋亡率为5.48%±0.10%(48h)和5.63%±0.11%(72h),较对照组0.50%±0.09%明显增加(P＜0.05).TUNEL检测见特有的凋亡征象,对照组则无明显变化.结论:沉默鸟苷酰环化酶C基因可促进胃癌细胞凋亡,可能为临床探索胃癌生物治疗提供新的靶点.
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鸟苷酰环化酶C质粒标准品的构建
目的:制备人鸟苷酰环化酶C(GC-C)质粒标准品,为实时荧光定量PCR检测GC-C含量,探讨大肠癌患者外周血单个核细胞(PBMC)GC-C mRNA表达水平及临床意义奠定基础.方法:在鸟苷酰环化酶C(GC-C)基因高保守区设计特异性的引物和探针,RT-PCR扩增目的片段并连接于pGEM-T载体,以得到GC-C质粒标准品.结果:经过蓝白斑筛选,PCR或EcoR I酶切初步鉴定,阳性克隆测序分析确定GC-C质粒标准品正确性.结论:正确构建GC-C质粒标准品为RFQ-PCR标准曲线的绘制及GC-C的定量检测奠定了基础.
