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HGF 对 TGF-β1诱导的α-SMA 阳性肌腱成纤维细胞的影响
目的：探讨肝细胞生长因子（HGF）对α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）阳性的肌成纤维细胞过度表达以及可能的内在作用机制。方法取大鼠跟腱原代培养成纤维细胞，应用TGF-β1（5.0 ng· mL-1）诱导肌成纤维细胞纤维化，加入或不加入HGF干预，采用MTT法测定细胞增殖水平，Western blot方法测定各组α-SMA表达水平及ERK蛋白表达水平。结果 HGF明显降低了TGF-β1诱导的肌腱成纤维细胞的过度增殖（0.127±0.083）；HGF阻抑了α-SMA蛋白的过度表达（0.67±0.07）倍；而且， HGF使诱导ERK1/2的表达从（2.04±0.25）倍到（4.11±0.17）倍。结论 HGF可以有效阻抑TGF-β1诱导的肌腱成纤维细胞α-SMA过度表达，可能通过ERK1/2途径抑制其纤维化作用。
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MTT法检测国产PGA支架对人成纤维细胞增殖的影响
目的 检测国产PGA支架对瘢痕、皮肤和肌腱成纤维细胞增殖的影响.方法 体外培养人瘢痕、皮肤和肌腱成纤维细胞,取第二代细胞接种到96 孔板,以不同浓度的国产PGA支架浸提液培养,用MTT法检测成纤维细胞在国产PGA上的增殖情况.结果 不同浸提液培养的瘢痕、皮肤和肌腱成纤维细胞的生长曲线均无明显差异.结论 国产PGA支架对瘢痕、皮肤和肌腱成纤维细胞的增殖无明显影响,该材料可以用于以成纤维细胞为种子的组织构建.
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Smad7在肌腱粘连组织中的表达及对肌腱成纤维细胞纤维化的作用
[目的]通过观察人肌腱粘连组织中Smad7的表达情况,并在TGF-β1诱导的肌腱成纤维细胞(TDFs))中沉默或过表达Smad7,观察细胞纤维化相关指标的变化,讨论Smad7在肌腱粘连中的作用及调控机制.[方法]收集肌腱粘连组织及正常肌腱腱周组织,Western blotting检测Smad7蛋白含量.设计并合成针对Smad7基因编码区的siRNA,同时构建Smad7基因表达载体,经脂质体转染至TDFs细胞,RealTime-PCR检测胞内Smad7基因含量,Western-blot检测细胞中Smad7蛋白表达;使用TGF-β1诱导转染后TDFs细胞,CCK-8检测细胞增殖活性变化,Western blotting检测纤维化相关的蛋白指标.[结果]与正常腱周组织比较,肌腱粘连组织中Smad7蛋白减少.siRNA及Smad7基因过表达载体转染TDFs,可以明显抑制或者上调细胞内Smad7基因含量及蛋白表达,与未转染组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);TGF-β1诱导的TDFs细胞,可以明显增强细胞增殖活性(P＜0.01,vs未诱导组),siRNA转染后,TGF-β1诱导TDFs增殖活性和纤维化蛋白指标上升的趋势进一步增强,Smad7基因表达载体转染则使得TGF-β1诱导TDFs增殖活性和纤维化蛋白指标增强的趋势得到明显抑制,基因干预且诱导组与只诱导组细胞活性和蛋白含量相比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).[结论]肌腱粘连组织中Smad7蛋白减少,提示肌腱粘连发生过程中Smad7表达受抑制;Smad7基因过表达可以抑制TGF-β1诱导TDFs细胞纤维化.
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miRNA219-5P靶向调控Smad4表达影响TGF-β1诱导肌腱成纤维细胞纤维化的研究
目的 探讨miRNA219-5P (miR219-5P)调控Smad4在TGF-β1诱导人肌腱成纤维细胞(tendon derived fibroblasts,TDFs)纤维化过程中的作用.方法 取患者自愿捐赠的肌腱组织分离培养TDFs,取第3代细胞进行实验.化学合成miR219-5P类似物(mimics)、阻遏物(inhibitor)及阴性对照序列,分别转染TDFs 48 h后,采用实时定量PCR及Western blot法分别检测miR219-5P基因及Smad4蛋白表达情况;以正常细胞作为空白对照.信息学软件预测miR219-5P与Smad4基因3'UTR区结合位点,构建Smad4预测基因3'UTR-PGL3重组质粒,构建野生型及突变型报告基因表达载体,并通过荧光素酶报告基因实验进行靶位验证.取正常及转染后TDFs,采用TGF-β1诱导细胞发生纤维化,于培养24、48、72 h采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖活性变化,72 h时采用Western blot法检测纤维化相关蛋白指标.结果 miR219-5P mimics转染TDFs可明显上调miR219-5P表达、下调Smad4蛋白表达,而miR219-5P inhibitor抑制细胞内miR219-5P表达、增加Smad4蛋白表达,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).荧光素酶实验显示,与pGL3-WT-Smad4转染组比较,pGL3-WT-Smad4+mimics转染组细胞内荧光素酶活性降低、pGL3-WT-Smad4+inhibitor转染组活性增强(P＜0.05);而pGL3-MT-Smad4+mimics转染组、pGL3-MT-Smad4+inhibitor转染组组间比较无明显变化(P＞0.05).与空白对照组比较,TGF-β1诱导培养72 h后细胞增殖活性明显增强(P＜0.01),同时上调细胞纤维化相关蛋白指标的表达(P＜0.01);与直接诱导组比较,miR219-5P过表达且诱导组TDFs细胞增殖活性和纤维化蛋白指标升高趋势得到抑制,而miR219-5P表达抑制且诱导组细胞增殖活性和纤维化蛋白指标则进一步增强,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 miR219-5P可通过抑制其靶基因Smad4表达,显著抑制TGF-β1诱导TDFs纤维化.
关键词： 肌腱粘连 肌腱成纤维细胞 miRNA219-5P Smad4 纤维化
