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结核分枝杆菌重组38kD蛋白用于新疆南疆维吾尔族和湖南湘中汉族血清学诊断的研究
目的:对结核分枝杆菌38kD蛋白编码基因进行克隆表达及纯化,建立基于重组38kD蛋白的酶联免疫吸附法(ELISA)检测结核病人血清标本,评价重组38kD蛋白用于结核病血清学诊断抗原的价值.并比较分析其在汉族和维吾尔族人群中的血清学诊断的差异.方法:用PCR方法扩增38kD蛋白的编码基因,构建重组质粒,转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达,得到纯化的38 kD蛋白,建立以38kD蛋白为包被抗原的ELISA,并检测临床确诊的结核病人血清标本.结果:ELISA检测结核病患者血清标本的维吾尔族阳性率为34％(52/153),汉族为52.4％(65/124),两者对比有统计学差异(X2=9.538,P＜0.005).在阴性对照中的维吾尔族特异度为96.4％(159/165),汉族为98.8％(130/133),结果无统计学意义(X2=0.111,P＞0.5).结论:重组38kD蛋白用于血清学诊断的敏感度在维吾尔族和汉族中有差异,而其诊断特异度无差别.
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结核分支杆菌38KD蛋白基因克隆及在大肠杆菌中的表达
目的构建和克隆结核分枝杆菌38kD蛋白的基因,以转基因技术导入大肠杆菌,诱导表达,以获得大量38kD抗原. 方法根据GenBank上编码38kD蛋白的基因系列,设计一对特异引物,通过PCR技术从结核分支杆菌H37Rv基因扩增出38kD蛋白基因片段;目的基因连接到克隆载体pMD 18-T Simple Vector,测序鉴定,目的片段双酶切下来克隆到原核表达载体pET-30a中,成功构建成带有N末6His-tag的融合表达载体.表达载体用化学转化法转化E. coli BL21(DE3),用菌落PCR筛选得到阳性克隆;经1mmol/L IPTG诱导4h表达外源蛋白;而且在37℃时蛋白表达量高;二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果. 结果 38kD序列与GenBank报道完全一致;用菌落PCR筛选得到阳性克隆;经1mmol/L IPTG诱导4h表达外源蛋白;而且在37℃时蛋白表达量高;二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果显示,在大约38kD处有表达产物特异条带;可溶性分析表明,该重组蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体的形式存在;纯化的包涵体纯度达到90%. 结论获得38kD蛋白工程菌株,为将此抗原用于临床诊断应用打下基础.
