首页 > 文献资料
-
结构域Ⅰ缺失的丙型肝炎病毒5'NCR调控荧光素酶基因的表达
目的:分析丙型肝炎病毒(HCV)5'端非编码区(NCR)的结构域Ⅰ序列在其翻译启动活性中的作用.方法:以质粒pCMVNCRluc为模板,PCR扩增分别得到缺失5'端20nt和43nt的HCV 5'NCR片段,并分别替换pCMVNCRluc中的完整HCV 5NCR,构建结构域Ⅰ缺失的HCV 5'NCR调控萤火虫荧光素酶(luc)基因表达的真核表达质粒(pCNl-d1、pCNl-d2).以脂质体方法转染人肝癌细胞株HepG2,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶相对于内参考的海肾荧光素酶表达活性,同时采用RT-PCR方法检测转染后细胞中萤火虫荧光素酶基因的相对表达水平.结果:酶切和测序结果表明,各重组质粒构建成功.各重组质粒转染细胞后luc mRNA的相对表达水平与pCMVNCRluc相比差异无显著性(P＞0.05);pCNl-d1、pCNl-d2表达的荧光素酶活性与pCMVNCRluc差异无显著性(P＞0.05).结论:HCV 5NCR的5'端20nt和43nt序列缺失不影响它的翻译启动活性.
-
丙型肝炎病毒5'端非编码区的5'端序列对其翻译启动活性的影响
目的分析丙型肝炎病毒(HCV)5'端非编码区(5'NCR)的5'端序列对其翻译启动活性的影响.方法用PCR技术扩增获得全长和5'端17个碱基缺失的HCV 5'NCR片段,定向克隆至表达质粒pSEAP2-Control的SEAP基因上游,分别构建成全长和5'端截短的HCV 5'NCR调控SEAP表达的重组质粒pNCRSEAP和pdNCRSEAP.用脂质体方法将重组质粒转染至肝细胞株QSG7701,并用化学发光法检测SEAP的表达.结果酶切和测序结果表明,重组质粒pNCRSEAP和pdNCRSEAP构建成功.表达的发光强度分别为390482±42856和635265±52285RLU,二者有差异显著性(P＜0.01).结论 HCV 5'NCR的5'端碱基缺失提高了它对SEAP基因的翻译启动活性,为进一步分析HCV IRES的结构提供了实验基础.
-
丙型肝炎病毒5'端非编码区结构域Ⅱ、Ⅱ在其翻译启动活性中的作用具有细胞特异性
目的：分析在不同宿主细胞的翻译体系下，缺失不同片段的HCV 5'UTR翻译启动活性的差异。方法以脂质体介导基因转染技术，将截短型HCV 5'UTR调控Fluc的真核表达质粒与Rluc真核表达质粒pRL-TK共转染至不同的细胞中，转染后36 h：①提取细胞RNA，半定量RT-PCR检测目的质粒的转录水平；②用双荧光素酶报告基因检测系统检测Fluc基因相对表达活性，分析HCV 5'UTR缺失不同结构域后在不同翻译体系中翻译启动活性的差异。结果⑴缺失5'端44个碱基的HCV 5'UTR的翻译启动活性分别与缺失前相比：在HeLa细胞和C6细胞中无明显影响，在L-02细胞中活性下降为46%，而在293T细胞则为缺失前的146%；⑵缺失5'端118个碱基后，HCV 5'UTR的活性分别与缺失前相比：在HeLa细胞中，缺失后活性仅为缺失前的49%，而在L-02细胞、C6细胞和293T细胞中，活性分别为缺失前的140%、160%和235%。在本研究使用的四种细胞中，pCNl的翻译启动活性的差异无统计学意义，pCNl-d2在293T细胞中活性高，在L-02细胞中活性低。pCNl-d3在293T、C6和L-2细胞中活性相近，但在HeLa细胞中的活性明显比其他细胞低。结论 HCV 5'UTR的DomainⅠ和DomainⅡ对其翻译启动活性的影响与宿主细胞种类相关，具细胞特异性。
