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重组免疫毒素EBI3-Luffin P1原核表达质粒的构建、表达及其生物学活性
目的 构建重组免疫毒素EBI3-Luffin P1的原核表达质粒,在大肠杆菌中进行表达,纯化后初步检测其生物学活性.方法 从质粒pET-32a-EBI3中扩增EBI3基因,与合成的Luffin P1基因连接,克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组质粒pET-32a-EBI3-Luffin P1,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达的重组EBI3-Luffin P1蛋白经亲和层析纯化后,Western blot检测其反应原性,体外试验初步鉴定其生物学活性.结果 重组质粒pET-32a-EBI3-Luffin P1经双酶切及测序证实构建正确；表达的重组EBI3-Luffin P1蛋白相对分子质量约为50 000,主要以包涵体形式存在,诱导8h表达量可达菌体总蛋白的44％；纯化的重组蛋白纯度约为98％,可与EBI3蛋白免疫小鼠血清发生特异性反应,并可显著抑制小鼠脾脏细胞分泌IFNγ.结论 成功构建了重组免疫毒素EBI3-Luffin P1的原核表达质粒,表达并纯化了重组蛋白,为进一步研究其在缓解、治疗免疫性疾病及红白血病中的作用奠定了基础.
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重组免疫毒素hlL-2-Luffin P1的构建及表达
目的构建人分泌型IL-2与免疫毒素Luffin P1的重组基因原核表达载体,并对其产物进行鉴定及纯化.方法采用基因工程原理,将IL-2-Luffin P1的重组基因片段克隆入表达载体pET20b(+)中,经酶切及DNA序列测定鉴定正确,转化表达宿主菌Origami(DE3)pLysS中,经IPTG诱导表达含His标签的融合蛋白-重组免疫毒素hlL-2-Luffin P1.结果成功构建了免疫毒素表达载体pET20b(+)-hIL-2-Luffin P1,获得纯化的重组免疫毒素,并经Western blot鉴定正确.结论hIL-2-Luffin P1的成功构建,为进一步研究它在抗移植排斥中的作用奠定了基础.
关键词： 免疫毒素 Luffin P1 Western blot -
Luffin P1-KDEL的构建、表达、纯化及鉴定
目的 构建植物毒素Luffin P1的原核表达质粒PET32a(+)一Luffin P1,并对其进行诱导表达,以及表达蛋白的纯化及鉴定.方法 采用基因工程技术将重组基因片段Luffin P1克隆到表达载体pET32a(+)中,经酶切及DNA序列分析正确后,转化至表达宿主菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达Luffin P1融合蛋白,并用His标签抗体对该融合蛋白进行Western blot鉴定,对鉴定正确的融合蛋白进行纯化,肠激酶酶切及再纯化.结果 成功的构建了原核表达载体pET32a(+)-Luffin P1,获得了纯度较高的Luffin P1蛋白.结论 通过基因工程合成Luffin P1蛋白是成功的,并为进一步对Luffin P1功能研究及制备免疫毒素的弹头鉴定了实验基础.
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重组免疫毒素的纯化及鉴定
目的 构建能特异性杀伤银屑病皮损中T淋巴细胞的重组免疫毒素hIL-2-Luffin P1.方法 应用PCR扩增目的基因片段hIL2-Luffin P1,然后克隆到表达载体pET32a(+)中,并对重组质粒进行酶切鉴定及基因测序.测序正确的重组质粒转化到表达菌BL21中,进行诱导表达.诱导表达正确的蛋白,经过蛋白的纯化、复性、脱盐、肠激酶酶切、再纯化,后用兔抗人IL-2多克隆抗体对目的蛋白进行Western blot鉴定.结果 构建了pET32a (+)-hIL-2-Luffin P1表达载体.后得到了表达正确的hIL2-Luffin P1蛋白.结论 重组免疫毒素hIL-2-Luffin P1的成功构建为银屑病的治疗奠定了实验基础.
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重组免疫毒素hIL2-Luffin P1的构建、表达及鉴定
目的 构建、诱导表达并鉴定可用于特异性杀伤皮肤T细胞淋巴瘤的免疫毒素hIL-2-Luffin P1.方法 采用基因工程技术将重组基因片段hIL-2-Luffin P1克隆入新的表达载体pET32a(+)中,经酶切及DNA序列测定进行鉴定并证实正确后,转化至表达宿主菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达hIL-2-Luffin P1融合蛋白,行Western blot用His标签抗体和鼠抗人IL-2抗体对该融合蛋白进行鉴定.结果 成功构建了重组免疫毒素表达载体pET32a(+)-hIL-2-Luffin P1,经Western blot鉴定证实诱导表达的重组免疫毒素hIL-2-Luffin P1融合蛋白的正确.结论 重组免疫毒素hIL-2-Luffin P1的成功构建为进一步研究其对皮肤T细胞淋巴瘤的杀伤作用奠定了实验基础.
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核糖体失活蛋白Luffin P1的构建
目的:构建免疫毒素Luffin P1的基因原核表达载体,获得免疫毒素Luffin P1,并对其进行鉴定及纯化.方法:设计寡聚核苷酸片段连接延长合成全长Luffin P1,PCR扩增后将其克隆入表达载体pET20b(+)中,经酶切及DNA序列测定鉴定正确,转化表达宿主菌Origami(DE3)pLysS中,经IPTG诱导表达蛋白Luffin P1,Western blot鉴定.结果:成功构建了免疫毒素表达载体pET20b(+)-Luffin P1,获得纯化的免疫毒素,并经Western blot鉴定正确.结论:通过基因工程成功表达免疫毒素Luffin P1,简化了其制备过程,有利于对其进一步研究应用.
