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缓释定向释放型IgY微胶囊的制备及其效果评价
目的 制备缓释定向释放型IgY微胶囊,并评价其效果.方法 采用喷雾干燥法,以明胶、海藻酸钠为微胶囊壁材,制备抗仔猪病原性腹泻IgY微胶囊.以IgY的活性、包封率、体外释放性能及稳定性为评价指标,通过单因素分析和L9(34)正交试验,分别从成囊材料的配比对微胶囊性能的影响、制备微胶囊成囊乳化液的稳定性影响冈素以及喷雾干燥条件3方面对IgY微胶囊制备条件进行优化,并评价微胶囊的IgY活性、包封率、在人工胃液(simulated gastric fluid,SGF)和人工肠液(simulated intestinal fluid,SIF)中的缓释效果及稳定性.结果 筛选出的制备微胶囊的佳工艺条件为:明胶浓度4％、海藻酸钠浓度0.75％,按IgY与明胶-海藻酸钠质量比为3∶4加入IgY,乳化后按进风温度170℃,进料速度10 ml/min,干燥时间10s,出口温度70℃进行喷雾干燥.在此工艺条件下制备的IgY微胶囊包封率为77.4％,活性保持在85％以上;在SGF中2 h释放率为8.6％,在SIF中4h释放率为81.2％;90℃加热30 s仍可保持50％以上的活性,常温(25 ～ 30℃)放置10个月活性仍保持在90％以上,4℃保存10个月活性仅下降5％.结论 本工艺制备的明胶-海藻酸钠IgY微胶囊具有生物活性高,稳定性强的特点,且对特异性IgY具有缓释和靶向作用.
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抗甲型肝炎病毒卵黄免疫球蛋白的制备及应用
目的 制备抗甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)卵黄免疫球蛋白(immunoglobulin of yolk,IgY),并建立双抗体夹心ELISA法,用于测定甲肝疫苗中的HAV抗原含量.方法 用纯化的HAV免疫健康产蛋母鸡,制备抗HAVIgY,采用多步骤分离纯化IgY,紫外分光光度法测定纯化IgY的蛋白含量,还原型SDS-PAGE分析IgY的相对分子质量及纯度,间接ELISA法检测IgY的效价、特异性及其热稳定性和酸碱稳定性.以纯化的IgY作为包被抗体,HRP标记的抗HAV单克隆抗体作为二抗,建立双抗体夹心ELISA法,对疫苗生产过程中的HAV抗原含量进行测定,并与市售ELISA试剂盒的检测结果进行比较.结果 亲和层析纯化后的抗HAV IgY浓度为3.67 mg/ml;重链和轻链的相对分子质量分别为66 000和27 000,纯度为96.78％;效价高为1∶16000;纯化的抗HAV IgY只与HAV呈阳性反应,与脊髓灰质炎病毒和肠道病毒71 (enterovirus 71,EV71)均不反应;纯化的抗HAV IgY在25～ 70℃条件下处理15 min及经pH 3.0～ 10.0的Tris-HCL缓冲液处理2h,其抗体效价基本无影响.建立的双抗体夹心ELISA法HAV浓度在15.62～2 000.00 ng/ml范围内,HAV浓度的对数值与A450值之间呈线性相关,R2=0.935,低检测量为7.81 ng/ml,与市售试剂盒检测结果具有良好的相关性,相关系数为0.952 7.结论 制备的抗HAV IgY浓度、纯度、效价均较高,特异性较强,稳定性良好,建立的双抗体夹心ELISA法可用于检测甲肝疫苗生产过程中HAV的抗原含量.
关键词： 肝炎病毒 甲型 免疫球蛋白Y 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 -
被动免疫治疗豚鼠过敏性支气管哮喘的疗效
目的 探讨低剂量的抗白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)免疫球蛋白Y(IgY)雾化吸入治疗豚鼠过敏性支气管哮喘的疗效.方法 将118只豚鼠随机分为正常对照组(15只,给予0.9％氯化钠注射液雾化吸入)、A组[模型组,19只,给予1.o％卵清白蛋白(OVA)氯化钠注射液、1.5％OVA氯化钠注射液及0.9％氯化钠注射液雾化吸入]、B组(IgY治疗组,18只,给予1.0％OVA氯化钠注射液、1.5％OVA氯化钠注射液及0.1％抗IL-1β和TNF-d IgY雾化吸入)和C组(阳性治疗组,18只,给予1.o％OVA氯化钠注射液、1.5％OVA氯化钠注射液及布地奈德混悬液雾化吸入).治疗后的2、4、8、24 h采用ELISA法检测炎症细胞因子(IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、IL-16、TNF-α、TGF-β1、IgE)的水平,亚甲蓝及伊红染色计数嗜酸性粒细胞,采用HE染色观察肺组织的病理变化.结果 B、C2组在不同时间点血中嗜酸性粒细胞和血浆中IL-1β、IL-16、TGF-β1、IgE水平均显著低于A组 (均P＜0.05),而BALF的上清液中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、ID16、TNF-α、TGF-β1、IgE水平均显著低于A组(均P＜0.05).B、C2组炎症病理反应明显减轻.A组血浆中IL-1β水平与IL-4、IL-8、IL-16、TNF-α水平均呈正相关(均P＜0.05),血浆中TNF-α水平与IL-6、IL-16、TGF-β1、IgE水平均呈正相关(均P＜0.05);BALF中IL-1β水平与IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、IL-16、TNF-α、TGF-β1、IgE水平均呈正相关(均P＜0.05),BALF中TNF-α水平与IL-1β、IL-4、IL-8、IL-13、IL-16、IgE水平均呈正相关(均P＜0.05).结论 低剂量的抗IL-1β和TNF-α IgY雾化吸入治疗豚鼠过敏性支气管哮喘具有显著的疗效,并能够显著地减轻豚鼠过敏性支气管哮喘炎症病理反应.
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响应面法优化IgY抑制具核梭杆菌增殖的研究
目的:利用响应面法研究免疫球蛋白Y(IgY)影响口腔唾液模拟环境中具核梭杆菌(F.nucleatum)的生长繁殖特性,发现F.nucleatum终菌落数与培养时间、F.nucleatum初始接种浓度和IgY剂量的关系.方法:以F.nucleatum终菌落数为评价指标,在单因素试验基础上,设计三因素三水平响应面实验进行优化,通过响应面法对回归方程的分析,得到各因素佳条件,优化后的条件重复试验3次,以验证模型的准确性.结果:以2×106 CFU/mL初始浓度接种F.nucleatum、181 mmol/L剂量给药IgY,培养时间6h得到终菌落数4.52×104CFU/mL,与预测值相对误差小于5％,方差分析表明模型P值显著,缺失值P值不显著,理论值与实测值拟合度良好,优化后F.nucleatum终菌落数显著降低.结论:响应面法优化结果表明IgY能显著抑制口腔唾液模拟环境中具核梭杆菌的增殖,回归模型能够预测IgY影响口腔唾液模拟环境中F.nucleatum增殖的特性.
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抗伴放线放线杆菌IgY的制备及抑菌试验研究
目的:观察伴放线放线杆菌诱导母鸡产生特异性IgY抗体情况,以及其抑制伴放线放线杆菌(A.a)和牙龈二氧化碳噬纤维菌(C.g)生长效果.方法:应用免疫接种法、水稀释法、盐析法、液体培养抑菌法、以及ELISA法,诱导、提取和纯化IgY抗体,取一定量抗体与细菌共同培养,测定抑制伴放线放线杆菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌生长效果.结果:两步硫酸铵盐析沉淀的IgY抗体纯度达85.6%～90.3%;抗原结合效价为1∶ 32 000;抗伴放线放线杆菌IgY抗体与牙龈二氧化碳噬纤维菌交叉免疫反应的抗原结合效价为1∶ 8 000;当抗伴放线放线杆菌IgY抗体浓度在5.0、1.0、0.1 g/L时,细菌浓度在5×108 CFU/L培养24 h其抑菌率分别为31.60%(P=0.004)、10.24%(P=0.024)、-3.30%,培养72 h其抑菌率分别为64.20%(P=0.004)、53.21%(P=0.002)、11.20%.细菌浓度在1×108 CFU/L培养24 h其抑菌率分别为35.71%(P=0.004)、30.95% (P=0.012)、11.11%,培养72 h其抑菌率分别为65.11%(P=0.005)、54.04%(P=0.002)、16.17%;5.0 g/L的抗伴放线放线杆菌IgY与1×108 CFU/L牙龈二氧化碳噬纤维菌培养24 h其抑菌率为41.61%(P=0.005),培养72 h抑菌率为86.99%(P=0.014).结论:伴放线放线杆菌能够诱导母鸡产生高效价的特异性IgY抗体,该抗体在一定的浓度内有抑制伴放线放线杆菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌生长的作用;伴放线放线杆菌与牙龈二氧化碳噬纤维菌存在着共同抗原.
关键词： 伴放线放线杆菌 牙龈二氧化碳噬纤维菌 免疫球蛋白Y 细菌抑制 -
抗牙龈卟啉单胞菌卵黄抗体的制备、纯化和生物学特性鉴定
目的:制备特异性抗牙龈卟啉单胞菌( Pg)的鸡卵黄免疫球蛋白( IgY)并检测其生物学特性. 方法:厌氧培养牙龈卟啉单胞菌,将甲醛灭活的菌体经翅膀下浅层肌肉免疫150日龄罗曼母鸡3次,每次间隔10 d. 取鸡蛋用两步硫酸铵沉淀法提取IgY,BCA法测定蛋白质含量,ELLSA法检测纯化后IgY的特异性和抗体效价变化,并进行 SDS-PAGE 和 Western blotting 分析. 观察抗 Pg-IgY 对红细胞凝集的抑制作用.结果:经3次免疫后,抗体滴度高可达25 600,纯化后每个鸡蛋可得约70 mg IgY抗体;SDS-PAGE分析,纯化的IgY有1条主要蛋白带,相对分子质量( Mr)为180 kD,纯度为65%; Western blotting分析, 该IgY抗体可识别抗原Pg. 每孔3. 125 μg Pg-IgY可有效抑制Pg的红细胞凝集活性;1 mg/mL Pg-IgY可有效抑制Pg生长.结论:本研究得到的IgY特异性强,产量和纯度高.
