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狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3区缺失转移表达载体的构建及表达
目的构建狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3缺失转移表达载体,并在MDCK细胞系统中高效表达.方法将含狂犬病毒SRV9株糖蛋白(Rgp)cDNA的pGT载体,经双酶切后回收Rgp基因片段,与经双酶切的真核表达载体pIRES1neo连接,得到pIRES1Rgap,再经双酶切后回收2 623 bp片段,与E3缺失载体pBE3L连接,得到含狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3缺失转移表达载体pBE3LCRgp,再转染MDCK细胞.结果pBE3LCRgp转染的MDCK细胞,经间接ELISA和间接免疫荧光法在其培养上清中均能检出Rgp的高效表达.结论已成功构建狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3缺失转移表达载体,并在MDCK细胞中高效表达.
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重组新城疫病毒rL-RV G诱导人胃腺癌细胞内质网应激和凋亡
目的：观察新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）及稳定表达狂犬病毒糖蛋白的重组新城疫病毒（re-combinant avirulent NDV LaSota strain expressing the rabies virus glycoprotein，rL-RVG）对胃腺癌HGC细胞内质网应激及凋亡的影响。方法：将HGC细胞随机分为对照组、NDV组和rL-RVG组，分别转染PBS、NDV和rL-RVG 24 h，免疫印迹法和免疫荧光检测糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）和CCAAT／增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT／enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）表达。再将HGC细胞随机分为对照组、4-苯基丁酸钠盐（sodium phenylbutyrate，4-PBA）组、rL-RVG组和4-PBA＋rL-RVG组，4-PBA组和4-PBA＋rL-RVG组分别加入4-PBA预处理4 h，然后rL-RVG组和4-PBA＋rL-RVG组分别转染rL-RVG，对照组和4-PBA组转染PBS，免疫印迹法检测各组细胞GRP78、CHOP和半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的表达，流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：感染HGC细胞24 h后，NDV组及rL-RVG组GRP78和CHOP表达明显高于对照组（P均＜0．05），且rL-RVG组明显高于NDV组（P＜0．01）。4-PBA预处理后，4-PBA＋rL-RVG组GRP78、CHOP、caspase-3蛋白表达和细胞凋亡率较rL-RVG组明显降低（P＜0．05）。结论：rL-RVG较NDV更易引起胃腺癌HGC细胞内质网应激，且与凋亡相关。
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狂犬病毒糖蛋白重组的新城疫病毒诱导人胃癌 SGC 细胞自噬
目的：观察狂犬病毒糖蛋白重组的新城疫病毒（rabies virus glycoprotein recombinated Newcastle disease vi-rus，rL-RVG）及野生型新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）对胃癌 SGC 细胞自噬的影响。方法：将 SGC 细胞随机分为3组，rl-RVG 组（转染 rl-RVG）、NDV 组（转染 NDV）、对照组（转染 PBS），24 h 后观察细胞的形态变化，评价病毒对细胞的影响。用免疫双标记和免疫印迹法鉴定病毒感染是否成功；蛋白质印迹检测各组细胞自噬相关蛋白 LC3及 Beclin1的表达；透射电镜观察细胞内超微结构的变化和自噬体的形成。结果：病毒感染细胞24 h 后， rl-RVG 组及 NDV 组细胞皱缩明显，且 rl-RVG 组较 NDV 组变化明显，对照组无明显变化；rl-RVG 组和 NDV 组细胞LC3及 Beclin1蛋白表达较对照组明显升高（P ＜0．05），且 rl-RVG 组明显高于 NDV 组（P ＜0．05）；rl-RVG 组及NDV 组出现的自噬体明显多于对照组，且 rl-RVG 组较 NDV 组明显增多（P ＜0．05）。结论：rL-RVG 较 NDV 更易引起胃癌 SGC 细胞的自噬。
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双表达狂犬病毒基因的非复制型痘苗病毒改建及免疫效果
为减少重组病毒非必需外源基因,进一步提高非复制重组痘苗病毒狂犬病疫苗的安全性,本研究改建不含报道基因LacZ的双表达狂犬病毒Ag株G、N的非复制重组痘苗病毒VTKRG△CKRN.采用G418-neo富集、蓝白斑及免疫蚀斑筛选等方法,以表达狂犬病毒糖蛋白(RG)基因的非复制重组痘苗病毒VTKRG△CKlacZ作为亲本株,利用同源重组原理,删除C与K片断间lacZ,并将狂犬病毒核蛋白(RN)基因插入C-K片段间.经核酸及蛋白水平检测表明VTKRG△CKRN能同时稳定有效地表达狂犬病毒G和N,并具有非复制病毒生长特性.重组病毒裸鼠毒力实验表明VTKRG△CKRN较复制型重组痘苗病毒VTKRG病毒毒力显著减弱.VTKRG△CKRN免疫小鼠可诱生较高有效中和抗体,并能保护小鼠免于致死剂量狂犬病毒攻击.以1.6×106PFU较低免疫剂量、仅一次免疫狗可保护狗经致死量中国狂犬病毒街毒株SBD株攻击后存活,诱生具有保护性中和抗体.非复制狂犬-痘苗重组病毒VTKRG△CKRN免疫效果好、更具安全性.
