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蛋白质转导序列文献资料
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神经元保护蛋白TAT-Bcl-XL的体外高效表达及其功能的初步研究
目的:在原核表达系统中表达对凋亡神经元具有保护作用的重要蛋白Bcl-XL与蛋白质转导序列(PTD)的融合蛋白,并检测重组蛋白对重金属离子所诱导的细胞凋亡的保护作用.方法:通过RT-PCR的方法,用Bcl-XL特异引物从乳腺癌细胞系MCF-7细胞的总RNA中扩增出Bcl-XL基因,构建相应的原核表达载体,体外表达的TAT-Bcl-XL融合蛋白经镍亲和层析介质纯化后,通过免疫荧光方法检测其转导293T细胞的能力;并用流式细胞仪检测融合蛋白抑制细胞凋亡的能力.结果:经RT-PCR从MCF-7细胞总RNA中得到相应的TAT-Bcl-XL基因片段,并将其克隆人pCRT7/CT-TOPO载体中,重组质粒pTBTOPO转化大肠杆菌后,在SDS-PAGE和Western blot的结果中出现了与预期分子量相同的蛋白条带和阳性信号,纯化的TAT-Bcl-XL重组蛋白经免疫荧光检测,主要分布于细胞的细胞质中.流式细胞仪的检测结果显示融合表达蛋白可以有效地抑制Zn2+离子所诱导的细胞凋亡,使细胞的存活率提高40%.结论:TAT-Bcl-XL融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,初步的功能性检测表明融合蛋白具有抑制细胞凋亡的功能.
