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透明颤菌血红蛋白基因的克隆与表达
目的用野生型透明颤菌菌株中获得的血红蛋白基因,构建透明血红蛋白(VHb)重组表达质粒,并在大肠埃希菌(E.cloi)中实现表达.方法将环境中筛选出的透明颤菌菌株,直接通过聚合酶链式反应(PCR)克隆血红蛋白基因,以质粒pBluescript SK为载体.构建透明颤菌血红蛋白重组表达质粒pBlueV,并转化到大肠埃希菌DH-5a中,使用CO示差光谱、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳(SDS-PAGE)电泳和蛋白印记(westernb lot)进行分析.结果PCR扩增的产物透明颤菌血红蛋白基因(vgb)在琼脂糖凝胶电泳图0.5kb处显示1条亮带,测序结果证实与已发表的vgb序列的同源性100%.经质粒转化的大肠埃希菌菌株在16kb处有1条特征蛋白带,而未经质粒转化的菌株则没有.结论成功构建透明颤菌血红蛋白重组质粒,并在大肠埃希菌中得到表达.
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透明颤菌血红蛋白基因在生黑葡萄糖酸杆菌中的克隆与表达
目的 在生黑葡萄糖酸杆菌中克隆并表达透明颤菌血红蛋白基因(Vitreoscilla Hemoglobin gene,vgb).方法 构建重组质粒pUC19-vgb并电转化生黑葡萄糖酸杆菌.采用十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfonate,SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳和一氧化碳(carbon monoxide,CO)-示差光谱进行血红蛋白表达和生物活性测定.结果 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示有大量与目的蛋白大小相当(约15 ku)的蛋白表达.CO-示差光谱在420 nm处有一吸收峰,显示重组质粒pUC19-vgb成功转化人生黑葡萄糖酸杆菌,并表达具有生物活性的透明颤菌血红蛋白(VitreosciHa Hemoglobin,VHb).结论 成功构建vgb重组质粒,并实现在生黑葡萄糖酸杆菌中表达VHb.
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在吸水链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白基因提高子囊霉素产量
为了解决子囊霉素(1)发酵过程低溶氧的问题,本研究将透明颤菌(Vitreoscilla)血红蛋白基因(vgb)整合至1生产菌株吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中,构建工程菌SIPI-FK520-2,通过RT-PCR分析检测到了vgb基因的转录表达,进一步利用CO结合差光谱分析也证实了工程菌中透明颤菌血红蛋白(VHb)具有生物活性.后在发酵罐进行该工程菌的发酵培养研究,结果表明,与野生菌相比,工程菌发酵过程溶氧水平明显改善,1产量提高了38％,达到1 269.7 mg/L.
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透明颤菌血红蛋白的研究及应用
透明颤菌血红蛋白是来自专性好氧的革兰氏阴性细菌透明颤菌属的一种同源双亚基血红蛋白,其基因的转录受生境中氧浓度的调节.当这种蛋白在多种原核及真核生物中表达时,具有促进生长和提高各种有用代谢产物的作用.证据显示该蛋白的作用机制是进行对氧的传递.
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透明颤菌血红蛋白基因在产黄青霉中的克隆与表达
将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)克隆至质粒载体pMK4中,构建成表达载体pMK4-LV,并将表达载体pMK4-LV转化青霉素生产菌株--产黄青霉的原生质体,获得转化子.经发酵实验表明,vgb的表达可以使产黄青霉的生物量提高9.76%,青霉素的产量提高9.68%.
