首页 > 文献资料
-
抗凝血酶基因T98I和A404T突变导致抗凝血酶缺陷症的分子机制研究
目的 研究抗凝血酶(AT)基因T98I和A404T突变致AT缺陷症的分子机制.方法 构建AT野生型和突变体表达质粒(ATwt、AT T98I、AT A404T)并瞬时转染至COS-7细胞或CHO细胞,进行体外表达试验、脉冲-追踪试验和细胞免疫荧光染色;用荧光实时PCR(RT-PCR)检测转染细胞AT mRNA表达量的改变;蛋白降解抑制实验检测突变蛋白在细胞内的降解途径.结果 AT T98I未从转染细胞内分泌且在细胞内逐渐降解,AT A404T仅部分从细胞内分泌、大部分未分泌并在细胞内逐渐降解.RT-PCR显示,与野生型AT mRNA相比,突变体AT mRNA不降低.脉冲-追踪试验发现,这两种AT突变体分泌障碍,未在细胞内聚集而是降解.蛋白降解抑制实验显示,突变体AT T98I通过蛋白体酶途径进行细胞内降解.转染细胞荧光染色显示,转染AT T98I质粒的CHO细胞内荧光强度明显减弱、无明显核周聚集,而转染AT A404T质粒的CHO细胞内荧光减弱且弥散分布于胞质、核周有轻度聚集.结论 分泌障碍和细胞内降解是AT基因T98I和A404T突变导致AT缺陷症的分子病理机制.
-
抗凝血酶基因G13328A杂合突变导致血栓形成
目的对1个遗传性抗凝血酶(AT)缺陷症家系进行AT抗原(AT:Ag)、活性(AT:A)和基因突变检测并对该突变导致的AT结构和功能的变化进行研究.方法采用免疫比浊法和发色底物法分别检测AT:Ag和AT:A,用PCR法对先证者AT基因的7个外显子及其侧翼内含子序列进行扩增,PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变.根据基因检测结果,对家系成员相应外显子进行PCR扩增,扩增产物直接测序.用大引物法构建突变的AT表达质粒并瞬时转染COS-7细胞,用ELISA法检测细胞培养上清液和细胞内提取物中AT:Ag.结果先证者的AT:Ag和AT:A分别为179 mg/L和42.3%,为Ⅰ型AT缺陷;AT基因测序显示在AT外显子6区存在G13328A杂合突变,导致Ala(GCC)404→Thr(ACC).对家系成员进行的基因测序显示有3人(Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅲ2)存在该突变.突变质粒在细胞培养上清液和细胞内的AT:Ag分别为正常人的40%和68%.结论该家系为Ⅰ型遗传性AT缺陷症;G13328A杂合突变是导致先证者血栓形成的原因.
