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先天性遗传性核性白内障家系致病基因GJA8突变型和野生型在真核细胞中的蛋白表达
目的 克隆一个先天性遗传性核性白内障家系致病基因GJA8,研究该基因野生型(wGJA8)和突变型(mGJA8)在体外真核细胞系中的表达.方法 以正常人类和家系患者基因组DNA为模板进行PCR扩增,分别调取wGJA8和mGJA8.构建质粒pEGFP-N1-wGJA8和pEGFP-N1-mGJA8,经双酶切测序鉴定后分别转染COS7细胞,用荧光显微镜观察蛋白表达情况,Western印迹和免疫组化法检测蛋白表达.结果 目的 基因wGJA8和mGJA8克隆成功,经双酶切和DNA测序证实质粒pEGFP-N1-wGJA8和pEGFP-N1-mGJA8构建成功.荧光显微镜观察到野生型蛋白和突变型蛋白在体外培养的COS7细胞内均有表达,Western印迹和免疫组化显示基因wGJA8和mGJA8在COS7细胞中均有蛋白表达.结论 成功克隆出该家系致病基因wGJA8和mGJA8,完成了致病基因在真核细胞中的蛋白表达,为进一步研究该家系白内障的确切发病机制奠定了基础.
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一个新的GJA8突变导致一家系遗传性白内障
目的 鉴定一个新的常染色体显性遗传性白内障家系的致病性基因突变.方法 在前期对本家系基因定位研究的基础上,通过对GJA8基因测序鉴定致病基因及酶切电泳验证突变.结果 对缝隙连接蛋白50(connexin 50,CX50;编码为GJA8)基因DNA序列分析鉴定显示其第2个外显子的773位核苷酸上C到T的杂和错义突变,引起其蛋白产物258位丝氨酸被苯丙氨酸替代.结论 本研究在一遗传性白内障家系发现并鉴定了一个新的GJA8错义突变(S258F),并认为其与导致该家系常染色体显性遗传性白内障发病有关.
关键词： 常染色体显性遗传性白内障 基因突变 GJA8 缝隙连接蛋白50 -
先天性核性白内障家系致病基因的克隆及在真核细胞中的表达
目的 克隆1个先天性核性白内障家系致病基因-突变型GJA8(mGJA8),研究其编码的蛋白质在真核细胞系中的表达和定位.方法 从研究发现的先天性核性白内障家系患者基因组中扩增突变型mGJA8,克隆入载体pGEF-T,然后酶切,定向克隆到真核表达质粒pEGFP-N1中,构建pEGFP-N1-mGJA8重组表达质粒,然后用限制性内切酶消化和DNA测序鉴定,后通过脂质体包埋转染法,用pEGFP-N1-mGJA8和pEGFP-N1质粒转染COS-7细胞,荧光显微镜观察其在COS-7细胞内的表达,采用细胞免疫组织化学法验证蛋白表达.结果 经双酶切和DNA序列测定,证实致病基因mGJA8重组质粒构建成功,荧光显微镜观察在COS-7细胞上致病基因mGJA8蛋白表达,细胞免疫组织化学法显示致病基因表达蛋白在COS-7细胞中特异性表达.结论 成功克隆出该家系的致病基因mGJA8,并且完成了该致病基因在体外真核细胞中的特异性表达,为进一步研究该家系的发病机制奠定基础.
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遗传性白内障家系的候选基因突变筛查
目的:对散发遗传性白内障患者主要候选基因突变进行筛查.方法:收集2例蓝点状白内障、2例人字缝白内障、1例海马状白内障患者外周血标本,应用蛋白酶K法提取白内障患者血液中的DNA,针对α晶体蛋白(CRYAs)、β晶体蛋白(CRYBs)、γ晶体蛋白(CRYGs)、缝隙连接蛋白-50(GJA8)基因外显子区域,用Primer3.0软件设计引物,用聚合酶链反应(PCR)和DNA测序、BLAST比对等方法检测CRYAs、CRYBs、CRYGs、GJA8基因的突变.结果:在CRYBA1中,发现两名蓝点状白内障患者在第2内含子区域5′端 + 75位的变异T → G,另外3例患者(表型为人字缝、海马状)未找到该变异.结论:蓝点状白内障患者的变异属于内含子的多态性位点,系该两例患者的一种遗传标记.此5例散发性白内障的致病基因突变,不存在于CRYAs、CRYBs、CRYGs、GJA8基因上,需继续筛查其他候选基因.
