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上皮组织特异性表达N-LMP1和CR2转基因猪胚胎成纤维细胞的构建与鉴定
目的 构建上皮组织特异性表达鼻咽癌来源潜伏膜蛋白1(N-LMP1)和人补体受体2(CR2)真核表达载体,转染猪胚胎成纤维细胞并筛选整合有N-LMP1和CR2基因的细胞克隆,为构建与EBV感染相关的猪鼻咽癌模型奠定基础.方法 通过直接合成ED-L2启动子和N-LMP1,从人B淋巴细胞中的RNA经RT-PCR扩增出CR2,将上述3个片段逐个连接到真核表达载体pN1上,构建上皮组织特异性表达N-LMP1和CR2的载体pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2;用脂质体转染猪胚胎成纤维细胞,经药物G418 筛选和PCR鉴定阳性克隆.结果 成功构建上皮组织特异性表达N-LMP1和CR2的真核表达载体pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2,并成功整合到猪胚胎成纤维细胞的基因组中,获得了整合有目的 基因N-LMP1和CR2的猪胚胎成纤维细胞克隆.结论 获得了上皮组织特异性表达N-LMP1和CR2 的猪胚胎成纤维细胞克隆,为通过细胞核移植方法获得表达N-LMP1和CR2转基因猪提供了供体细胞.
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表达Cre重组酶Cre-pCEP4载体的构建及其在Cre/loxP重组系统中的应用
目的:构建表达Cre重组酶的载体Cre-pCEP4,并验证其能够有效识别loxP位点,为人类疾病动物模型的建立提供依据.方法:构建重组载体Cre-pCEP4和pStop-eGFP,利用Fugene HD转染猪胚胎成纤维细胞(PEF)和MCF-7细胞系,利用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况.结果:成功构建重组载体Cre-pCEP4和pStop-eGFP,将2个载体瞬时共转染PEF;经潮酶素B筛选出Cre重组酶稳定表达的MCF-7细胞系瞬时转染pStop-eGFP,在荧光显微镜下观察2种细胞均有绿色荧光蛋白的表达.而单独转染pStop-eGFP的MCF-7细胞系和PEF均未见绿色荧光蛋白的表达.结论:重组载体Cre-pCEP4在细胞内能够表达Cre重组酶,并且表达的Cre重组酶能够识别loxP位点,删除两同向loxP间的DNA片段.
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骨骼肌特异性表达猪FSⅠ-Ⅰ转基因猪胚胎成纤维细胞克隆的构建与鉴定
目的:构建骨骼肌特异性表达猪FS Ⅰ-Ⅰ真核表达载体,转染猪胚胎成纤维细胞并筛选整合有FSⅠ -Ⅰ基因的细胞克隆,为研究FSⅠ-Ⅰ对猪骨骼肌的影响奠定基础.方法:通过RT-PCR方法从猪骨骼肌中扩增FS A(包含FS N端和结构域FS Ⅰ)和结构域FSⅠ；利用PCR方法分别从鼠基因组、人血液基因组和pcDNA3.1(+)载体上扩增出MCK增强子、ACTA 1启动子和BGHpolyA.将上述4个片段分别连接到真核表达载体pGKneotpAlox2上,构建骨骼肌特异性表达FS Ⅰ-Ⅰ(包含FS N端和2个连续FS Ⅰ结构域)的载体pGK-MCK-ACTA 1-FS Ⅰ -Ⅰ -BGHpolyA；用FuGENE(R) HD转染猪胚胎成纤维细胞,经药物G418筛选和PCR鉴定阳性克隆.结果:成功构建骨骼肌特异性表达猪FSⅠ-Ⅰ的表达载体pGK-MCK-ACTA1 promoter-FS Ⅰ -Ⅰ -BGHpolyA,并成功整合到猪胚胎成纤维细胞的基因组中,获得了整合有目的基因FSⅠ-Ⅰ的猪胚胎成纤维细胞克隆.结论:获得了骨骼肌特异性表达猪FS Ⅰ-Ⅰ的猪胚胎成纤维细胞克隆,为通过核移植方法获得表达FSⅠ -Ⅰ转基因猪提供了供体细胞.
