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OC-STAMP及其在巨噬细胞系细胞融合中作用机制的研究进展
破骨细胞(OC)是唯一执行骨吸收功能的细胞,来源于单核细胞/巨噬细胞谱系.在OC形成过程中,前体OC融合形成多核成熟OC.而细胞融合是一个非常复杂的生物学过程,需要一些特殊蛋白或分子参与.OC多次跨膜蛋白(OC-STAMP)是近年来新发现的细胞融合分子.在OC-STAMP基因敲除的小鼠体内,OC和外源异物巨噬细胞的融合都被完全抑制,且在OC-STAMP缺乏的OC中,其骨吸收功能也明显下降.目前,OC-STAMP调节细胞融合的机制尚未明确,研究认为OC-STAMP主要通过核因子κB和信号转导及转录激活因子家族所介导的信号通路发挥作用.
关键词： 破骨细胞多次跨膜蛋白 细胞融合 破骨细胞 外源异物巨噬细胞 -
OC-STAMP基因过表达载体及稳转细胞系的构建
目的 构建破骨细胞多次跨膜蛋白(OC-STAMP)基因过表达质粒,体外转染RAW264.7细胞构建稳转细胞系,为进一步研究OC-STAMP的功能提供工具.方法 根据NCBI数据库中OC-STAMP基因信息,设计引物,采用PCR扩增其基因片段;运用基因重组方法双酶切目的基因,并将其克隆至含有绿色荧光蛋白(GFP)的pCDH-CMV慢病毒载体,经酶切测序对重组质粒进行鉴定;转染成功构建的质粒至293T细胞中Western blotting验证蛋白过表达情况;采用psPAX2和pMD2.G两种包装质粒包装pCDH-CMV-oc-stamp重组质粒获得病毒液,病毒感染RAW264.7细胞获得OC-STAMP过表达稳转细胞系,Q-PCR和Western blotting验证蛋白过表达情况.结果 酶切和测序鉴定表明成功构建pCDH-CMV-oc-stamp的基因重组质粒;将成功构建的pCDH-CMV-oc-stamp质粒转染至293T,可观察到大量绿色荧光表达;将成功包装获得的病毒液感染RAW264.7细胞后q-PCR及Western blotting结果证实OC-STAMP成功过表达.结论 成功构建pCDH-CMV-oc-stamp重组质粒及OC-STAMP过表达的稳转细胞系.
关键词： 破骨细胞多次跨膜蛋白 质粒构建 病毒转染 RAW264.7细胞
