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重组人肝细胞生长因子改造后在酵母中二级结构活性的研究
目的 探讨人肝细胞生长因子(hHGF) 改造后重组hHGF(rhHGF) 蛋白在P.pastoris 酵母中二级结构的活性.方法 根据酵母偏爱密码子和Kex2 酶切识别位点,通过套叠PCR 技术对hHGF cDNA 进行改造并与pGEMTEasy 载体连接,蓝白斑筛选,Xba Ⅰ /Sal Ⅰ双酶切鉴定后测序.构建穿梭载体pPICZα A-rhHGF,Xba Ⅰ /Xho Ⅰ酶切鉴定.将穿梭载体质粒用Sac Ⅰ单酶切线性化,转化P.pastoris GS115 细胞,表型鉴定,拷贝数确定.采用甲醇诱导表达,选择表达量高的1 株进行温度控制性优化表达.对表达产物进行Western blot 分析和生物学活性测定.结果 Xba Ⅰ /Sal Ⅰ双酶切获得2.1kb 大小的片段,测序结果显示AAG 序列插入到目的 位置,其余序列正确.穿梭载体构建后,Xba Ⅰ /Xho Ⅰ双酶切鉴定显示为两条带,分别为580bp 和1074bp,与预期一致.转化P.pastoris GS115 细胞,PCR 鉴定表型均呈mut+,Zeocin 浓度筛选拷贝数均为1.选取其中6 个转化菌甲醇诱导,表达rhHGF 的浓度分别为14.5mg/L,14.6mg/L,16.1mg/L,18.7mg/L,19.3mg/L,20.5mg/L.还原状态下,SDS-PAGE 凝胶电泳显示为两条带.Western blot 检测显示在约80kDa 处有一条浓聚带,证实rhHGF 表达产物免疫原性存在.结论 经过基因改造的rhHGF 在P.pastoris 中获得表达,其表达产物的二级结构具备生物学活性,有增强HGF 的作用,但表达量尚待进一步提高.
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重组人肝细胞生长因子真核表达载体的构建
目的 构建重组人肝细胞生长因子(rhHGF)的真核表达载体,为后续毕赤酵母蛋白高效表达提供基础.方法 根据酵母表达偏爱密码子合成rhHGF cDNA全长序列,将rhHGF和pGAPZαA质粒双酶切后行连接转化,构建穿梭载体pGAPZαA-rhHGF,并鉴定.结果 重组真核表达载体pGAPZA-rhHGF经限制性内切酶分析,与理论值相符,测序结果未见碱基变异.结论 成功构建了pGAPZαA-rhHGF真核表达载体,为后续毕赤酵母高效表达rhHGF蛋白提供了可行性.
