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TRPV1基因的shRNA逆转录病毒载体的构建和鉴定
目的：构建针对人瞬态电压感受器阳离子通道，子类V，成员1(TRPV1)基因的pSUPERretro-puro TRPV1逆转录病毒表达载体，感染U87-MG细胞，观测其沉默TRPV1基因的效果。方法利用Ambion在线设计软件设计针对人TRPV1基因的shRNA干扰序列，克隆到pSUPERretro-puro载体上。对重组质粒进行DNA序列测定和酶切分析。用磷酸钙法制备pSUPERretro-puro TRPV1逆转录病毒，将其感染到U87-MG细胞，经嘌呤酶素筛选阳性克隆后采用荧光定量PCR及Western blotting法检测TRPV1表达。结果经DNA测序和酶切鉴定表明，pSUPERretro-puro TRPV1表达载体构建成功。pSUPERretro-puro TRPV1逆转录病毒感染U87-MG细胞后，细胞中TRPV1表达量明显降低。结论成功构建了针对人TRPV1基因的pSUPERretro-puro TRPV1表达载体。pSUPERretro-puro TRPV1能有效下调TRPV1基因在U87-MG细胞中的表达，为将来应用其研究TRPV1在利多卡因致细胞损伤中的作用奠定了基础。
关键词： 瞬态电压感受器阳离子通道 利多卡因 逆转录病毒 -
TRPV1基因过表达逆转录病毒载体的构建和鉴定
目的 TRPV1基因过表达逆转录病毒载体的构建和鉴定研究.方法 PCR法扩增TRPV1基因的编码序列,克隆到pBaBe-puro载体上.对重组质粒进行DNA序列测定和酶切分析.用磷酸钙法制备pBaBe-puro-TRPV1逆转录病毒,将其感染到U87-MG细胞,经嘌呤酶素筛选阳性克隆后用荧光定量PCR和Western blot法检测TRPV1表达.结果 经DNA测序和酶切鉴定表明,pBaBe-puro-TRPV1表达载体构建成功.pBaBe-puro-TRPV1逆转录病毒感染U87-MG细胞后,细胞中TRPV1表达量明显增高.结论 成功构建了人TRPV1基因的pBaBe-puro-TRPV1表达载体.pBaBe-puro-TRPV1能有效上调TRPV1基因在U87-MG细胞中的表达,为应用其研究TRPV1在利多卡因致细胞损伤中的作用奠定了基础.
关键词： 瞬态电压感受器阳离子通道 利多卡因 逆转录病毒
