首页 > 文献资料
-
细胞分化周期蛋白27基因沉默抑制GH3细胞迁移及其分泌功能
目的 进行3种全基因组外显子测序所得基因体外的功能验证,为垂体柄中断综合征病因研究的体内实验提供理论依据.方法 将细胞分化周期蛋白27(cell division cycle protein 27,CDC27)、神经纤维瘤病1型(neurofibromatosis type 1,NF1)、X染色体关联的泛素特异性蛋白酶9(ubiquitin specific peptidase 9,X-Linked,USP9X)三种基因经由小干扰RNA(siRNA)分别转染至细胞内,每种基因均设置实验组、阴性对照(negative control,NC)组、空白细胞组.通过RT-PCR筛选出各基因佳的siRNA敲低序列以用于复筛,Western bolt复筛各基因佳敲低序列在蛋白水平的表达,以确定目标基因进行下一步研究.依次运用CCK-8检测细胞增殖能力及形态,细胞划痕实验检测细胞迁移,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞分泌功能,Western bolt检测垂体特异性转录因子-1 (pit-oct-unc class 1 homeobox 1,POU1FI)和垂体特异性转录因子祖先蛋白(homeobox protein prophet of pit-1,PROP1)表达水平.结果 1)CDC27在siRNA 117和1968序列时能够达到稳定的沉默效率,并且在mRNA及蛋白两个水平上均能够被敲低,NF1和UPS9X仅能在mRNA水平上实现敲低而未实现蛋白水平的敲低,无法进行后续实验;2)CDC27沉默对于细胞的增殖及形态无明显影响(P＞ 0.05);3)CDC27沉默能够明显抑制细胞的迁移能力(P＜0.05);4)CDC27沉默能够明显抑制细胞分泌生长激素(growthhormone,GH)、泌乳素(prolactin,PRL)分泌(P均＜0.05),对促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)的分泌无明显影响(P＞0.05);5)CDC27沉默能够明显下调POU1F1与PROP1的表达水平(P＜0.05).结论 CDC27沉默可以抑制GH3细胞的迁移及其生长激素、泌乳素的分泌.
