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液质联用技术分析可溶性CD95-Fc融合蛋白N-糖组成
目的:分析鉴定可溶性CD95-Fc融合蛋白的N-糖组成.方法:采用GlycoWorks RapiFluor-MSN-糖分析试剂盒酶解并标记、纯化N-糖基,糖基纯化产物经Waters BEH Glycan糖蛋白分析柱分离后,依次进入荧光检测器和飞行时间质谱仪检测.结果:结合荧光和质谱检测结果,鉴定出15种糖型:G0-GN,G0F-GN,G0,G0F,Man5,G1F,G1F,G2F,G2F+SA,G2F+SA,G3F,G2F+2SA,G3F+SA,G3F+2SA和G3F+3SA;各糖型组分实测单同位素分子量与理论值差异均不足0.1Da;所占比例高的糖型依次为G0F(30％),G1F(25％),G2F+SA(14％)和G2F(13％);不同批次相同糖基组分保留时间的RSD均低于0.2％,峰面积百分比的RSD均低于15％.结论:本研究成功鉴定出可溶性CD95-Fc融合蛋白的15种主要糖型,不同批次的糖型荧光图谱基本一致,可作为UPLC法对可溶性CD95-Fc融合蛋白N-糖定性定量的标准参考图谱.
关键词： 可溶性CD95-Fc N-糖分析 超高效液相/质谱 荧光糖谱 糖型鉴定 -
RP-HPLC法测定可溶性CD95-Fc融合蛋白中异天冬氨酸的含量
目的 测定可溶性CD95-Fc融合蛋白中异天冬氨酸(IsoAsp)含量.方法 采用ISOQUANT(R)异天冬氨酸检测试剂盒结合反相高效液相色谱法测定样品中IsoAsp含量,采用Phenomenex Synergi 4μm Hydro RP-80 C18色谱柱(150 mm×3 mm,4μm),以7.9 mmol/L磷酸二氢钾-1.1 mmol/L磷酸氢二钾-10％甲醇为流动相A,以甲醇为流动相B,梯度洗脱,流速为0.43 mL/min.结果 对照品和3批原液中IsoAsp含量相近(0.30～0.32 mol/molsCD95-Fc),3批成品中IsoAsp含量明显增高(0.51～0.53 mol/mol sCD95-Fc);25℃和37℃处理24h后成品中IsoAsp含量无明显变化,60℃处理后明显增加.结论 该法适用于可溶性CD95-Fc融合蛋白中IsoAsp含量检测,高温处理可加快样品中IsoAsp生成.
关键词： 可溶性CD95-Fc 异天冬氨酸 脱酰胺修饰 反相高效液相色谱
