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RNase L文献资料
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利用CRISPR/Cas方法建立RNase L基因稳定敲除细胞株
目的:利用CRISPR/Cas9技术建立人RNase L基因稳定敲除的细胞株。方法根据GenBank中RNase L基因序列,设计RNase L敲除的小指导RNA( sgRNA)序列,将其克隆到pCas-Guide真核表达载体中,获得pCas指导RNA( gRNA)载体;设计供体DNA的同源臂序列,通过搭桥PCR将左同源臂、潮霉素B抗性基因和右同源臂扩增成为一条片段作为同源重组的修复模板,并将其克隆到pBackZero-T表达载体上,获得pBackZero-T-RNase LK载体。将上述两个载体共转染HEK293细胞,用潮霉素B筛选,通过Western印迹和DNA测序等技术验证RNase L从基因组上敲除。结果与结论成功构建了载体pCas-gRNA和pBackZero-T-RNase LK,Western印迹和DNA测序结果表明,成功获得5株RNase L缺失的细胞株,为探讨RNase L的生物学功能和研究其分子机制奠定了基础。