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SYBR Green I法文献资料
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大鼠bFGF基因荧光定量PCR检测方法的建立
目的 建立用荧光定量PCR方法检测大鼠bFGF基因mRNA水平.方法 以Trizol-步法提取新鲜骨组织总RNA,以Oligo(dt)18为引物逆转录产生eDNA并进行扩增,以T-A克隆法将纯化的目的片断与PGEM.T Easy载体连接成重组质粒并转化E.coli DH5a.采用碱裂解法提取重组质粒,经蓝白筛选、酶切、测序鉴定后,根据标准品建立标准曲线,由软件自动计算出待测样本中靶基因mRNA准确含量,并以靶基因和内参GAPDH mRNA含量的比值作为评价靶基因表达水平的指标.结果 由PGEM.T Easv.bFGF所构建的标准曲线线性关系良好(反应体系中含1×102-1×107拷贝大鼠bFGF基因分子时,扩增反应Ct值与拷贝数的对数成线性关系)、灵敏度高、特异性强、准确可靠.批内和批间重复性测定的变异系数分别为1.03%～4.59%以及2.24%～6.46%.结论 成功建立了用实时荧光定量PCR检测大鼠bFGF基因表达量的方法.
