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基于纳米技术的超微量蛋白免疫分析ERK的磷酸化
目的 运用基于纳米技术的超微量蛋白免疫分析(Nanofluidic proteomic immunoassay,NIA)方法检测ERK的磷酸化.方法 构建尾加压素Ⅱ (Urotensin Ⅱ)受体GPR14细胞系,UⅡ(10-7M)刺激该细胞系10分钟后,提取细胞蛋白采用传统Western方法和NIA技术分别检测同种样品ERK的磷酸化,并用两种方法观察UⅡ受体拮抗剂Urantide对ERK磷酸化的抑制作用.通过结扎C57BL/6小鼠冠状动脉左前降支,建立心梗模型,假手术组开胸不结扎,术后1周通过流式细胞术分离心脏侧群干细胞(Cardiac side population cells,CSPs),用N1A技术检测ERK磷酸化.结果 Western分析可观察到UⅡ介导ERK1/2的磷酸化,Urantide抑制该效应.NIA分析可观察到UⅡ介导ERK1/2磷酸化的多种异构体包括p-ERK1a,p-ERK1b,pp-ERK1,pp-ERK2水平升高,Urantide同样抑制该效应.心梗后CSPs数目明显增加.NIA分析显示,心梗促进CSPs上的p-ERK1b,pp-ERK1的水平升高,但对pp-ERK2影响不大.结论 通过GPR14细胞系的分析,NIA技术灵敏度高,可检测ERK磷酸化的多种形式,运用该技术可检测数万个CSPs的ERK磷酸化,可观察心梗促进CSPs的某些ERK磷酸化异构体的水平升高,提示可能与心梗后CSPs的增殖有关.
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机械牵张调控LRP6磷酸化介导心脏侧群干细胞增殖
目的 研究机械牵张对心脏侧群干细胞(cardiac side population cell,CSP)增殖的作用及机制.方法 通过流式细胞仪分选并培养大鼠乳鼠CSP,牵张后观察细胞的增殖.并通过胸主动脉缩窄(transverse aorta constriction,TAC)建立压力负荷小鼠模型,流式细胞仪分选后观察CSP的比例.进一步通过荧光染色以及Western blot检测CSP的LRP6磷酸化水平.结果 成功分离及培养CSP,机械牵张可促进CSP增殖.体内实验表明,压力负荷可明显促进CSP比例的升高.免疫荧光及Western blot实验表明,机械牵张可明显促进CSP的LPR6磷酸化.CSP过表达LRP6可明显增强机械牵张介导的促增殖效应.结论 机械牵张可促进LRP6磷酸化,从而促进CSP增殖,有利于机体对病理性刺激产生适应性反应以维持心功能.
