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DNA微点阵分析丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B对信号传导相关基因表达的影响
目的采用DNA微点阵(DNA microarray)技术检测致癌相关基因的表达水平,研究丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)非结构蛋白NS4B在HCV致癌中的作用. 方法通过建立稳定表达NS4B的细胞系,用微点阵技术研究NS4B 对细胞基因表达的影响,实时定量RT-PCR分析微点阵结果中的两个上调基因(DKK1,FYN)和两个下调基因(AKR1C1,v-fos)的表达,对细胞中AKR1C1的活性进行酶学分析. 结果在2 308个信号途径相关的基因中,34个基因表达上调,56个基因表达下调.在表达有明显差异的基因中,大部分原癌基因表达上调,而大部分抑癌基因的表达下调;一些基因与细胞压力有关.实时定量RT-PCR和AKR1C1的酶学分析进一步证实了DNA微点阵的结果. 结论 HCV-NS4B在HCV的致癌过程中起一定作用.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B反式激活基因的克隆化研究
目的应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)转染细胞差异表达cDNA消减文库,克隆HCV NS4B蛋白反式激活相关基因.方法以HCV NS4B表达质粒pcDNA3.1(-)-NS4B转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,进行抑制性消减杂交分析.将富集的二次PCR产物与T/A载体连接,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆聚合酶链反应(PCR)扩增后进行测序及同源性分析.结果文库扩增后得到33个阳性克隆,经菌落PCR分析显示其中28个克隆含有大小不等的200～1000 bp插入片段.测序及同源性分析显示,12种已知基因编码蛋白,包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因,可能是NS4B反式激活靶基因.结论成功构建了HCV NS4B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,为进一步阐明HCV NS4B反式调节的靶基因在肝炎、肝纤维化和肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据.
